[发明专利]具有热稳定性增加的突变型逆转录酶以及涉及其的产物、方法和用途

说明书

本发明涉及相对于野生型具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），编码突变型RT的核酸，包含突变型RT或核酸的细胞，包含突变型RT的试剂盒，突变型RT用于cDNA合成的用途，使用突变型RT用于逆转录包含合成cDNA的RNA的方法，以及使用突变型RT检测样品中的RNA标记物的方法。

本发明涉及相对于野生型具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），编码突变型RT的核酸，包含所述突变型RT或所述核酸的细胞，包含所述突变型RT的试剂盒，突变型RT用于cDNA合成的用途，使用突变型RT用于逆转录包含合成cDNA 的RNA的方法，以及使用突变型RT检测样品中的RNA标记物的方法。

逆转录酶（RT）[EC 2.7.7.49]是负责病毒基因组复制的酶。它具有RNA和DNA依赖性DNA聚合酶以及RNA酶H活性。来自莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）和禽成髓细胞瘤病毒（AMV）的RT广泛用于cDNA合成中，因为它们具有高催化活性和保真度。对于cDNA合成，较高的反应温度是期望的，因为它减少RNA二级结构和非特异性引物结合。因此，改善RT的热稳定性是重要目的。MMLV RT的热稳定性（Kotewicz等人，1985；Gerard等人，2002；Mizuno等人，2010）已通过消除RNA酶H活性得到改善。近年来，MMLV RT的热稳定性通过以下得到进一步改善：在已牵涉与模板-引物的相互作用的位置处引入正电荷（Yasukawa等人，2010）；随机诱变（Arezi和Hogrefe，2009；Baranauskas等人，2012），以及将表面疏水性残基改变成亲水性残基（Konishi等人，2014）。因此，cDNA合成的反应温度已从37−45℃增加到50−55℃。然而，需要进一步的稳定，以改善cDNA合成的效率。

对于各种酶，已广泛执行定点诱变和/或随机突变，并且已鉴定了赋予酶期望特性如增强的催化活性或热稳定性的各种突变。如果这些突变的效应是累加的，则具有多重突变的变体酶将具有更期望的特性。然而，一般已知在各种酶的活性和稳定性之间存在妥协：增加酶活性的突变伴随着蛋白质稳定性的降低，并且增加蛋白稳定性的那些突变的确降低了酶活性（Shoichet等人，1995）。另外，目前很难预测突变组合对酶特性的作用。MM3（E286R/E302K/L435R）是热稳定的MMLV RT三重变体，其通过将旨在增加正电荷的三个突变引入野生型MMLV RT内而生成（Yasukawa等人，2010）。

然而，本发明的目的是提供衍生自MMLV的进一步的热稳定突变型逆转录酶。

为此，设计了29个突变。在大肠杆菌（Escherichia coli）中产生相应的单个变体，并且表征活性和稳定性，并且选择了六个突变（Ala32→Val、Leu41→Asp、Leu72→Arg、Ile212→Arg、Leu272→Glu和Trp388→Arg）。通过将六个突变中的一个或多个与MM3突变结合，设计了15种多重变体。产生并表征了相应的多重变体。六重变体MM3.14（A32V/L72R/E286R/E302K/W388R/L435R）显示出比野生型或突变型MM3更高的热稳定性（参见实施例2以及图4E、4F、5和6）。

相应地，在第一个方面，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1的野生型RT具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），所述突变型RT包含：

i）相对于SEQ ID NO：1的野生型RT具有六个氨基酸取代的氨基酸序列，其中

- 在位置32处的Ala被Val取代（A32V）；

- 在位置72处的Leu被Arg取代（L72R）；

- 在位置286处的Glu被Arg取代（E286R）；

- 在位置302处的Glu被Lys取代（E302K）；

- 在位置388处的Trp被Arg取代（W388R）；和

- 在位置435处的Leu被Arg取代（L435R），或