[发明专利]粗糙型肠炎沙门氏菌的获取及其用于禽流感疫苗的基因改造

权利要求书

1.肠炎沙门氏菌3934vac突变株，其中包含waaL基因的缺失。

2.肠炎沙门氏菌3934vac突变株的产生方法，其中包括：

·构建一个整合载体，构建时通过PCR分别扩增waaL基因两侧的两个片段，一个520bp(寡核苷酸A和B)，另一个504bp(寡核苷酸C和D)，其中寡核苷酸A、B、C和D为序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6

·分别在pKOB载体中提纯和克隆PCR产物以进行扩增，以获得用于扩增的pKOB::DwaaLR1载体，然后酶促分解、提纯并结合到pDESTINATION载体中。

·将在大肠杆菌中产生的载体pDEST::waaL进行转化，并通过PCR、微量制备和分解进行验证；一旦构建完成，pDEST::waaL质粒将在肠炎沙门氏菌3934vac和3934vac sb13::clyA-fiberFAdV菌株中进行电穿孔，在42℃下的生长及之后在28℃下的切除促使其整合。

·通过带有结构外部的寡核苷酸(waaL E和F)的PCR双同源重组验证waaL基因的缺失，其中寡核苷酸E和F为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

3.肠炎沙门氏菌重组禽类疫苗，其中包含肠炎沙门氏菌3934vac经过修改的突变株，waaL基因的缺失。

4.肠炎沙门氏菌3934vac突变株，其中包含AVA-I纤维基因的完整序列和waaL基因的缺失。

5.产生肠炎沙门氏菌3934vac突变株的方法，其中包括：

·拥有一个肠炎沙门氏菌3934菌株。

·通过同源重组的第一步插入选择盒，其中除抗生素抗性基因外，该盒在其侧翼区域还包含与前噬菌体ST64B互补的序列；在携带同源重组的第一步中选择盒的线性DNA存在下进行细菌电穿孔。

·同源重组第一步后，在含有抗生素的LB培养基中选择转化菌落。

·通过带有序列SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25寡核苷酸的PCR，确认肠炎沙门氏菌3934染色体中盒体的存在。

·通过同源重组的第二步插入ClyA-fiberFAdV-His表达盒，其中表达盒替换选择盒，表达盒包含序列SEQ ID NO：21

·通过蛋白质印迹和SDS-PAGE验证序列SEQ ID NO：21的表达产物，选择肠炎沙门氏菌3934vac sb13::clyA-fiberFAdV菌株。

6.根据声明5的方法，其中同样包括：

·构建一个整合载体，其中两个位于waaL基因两侧的片段，一个为520bp基因(分别为序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的寡核苷酸A和B)，另一个为504bp基因(别为序列SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6的寡核苷酸C和D)通过PCR扩增以构建整合载体。

·分别在pKOB载体提纯和克隆PCR产物进行扩增，以获得载体pKOB::DwaaLR1进行扩增，然后酶促分解、提纯并结合到pDESTINATION载体中。

·将在大肠杆菌中产生的载体pDEST::waaL进行转化，并通过PCR、微量制备和分解进行验证；一旦构建完成，pDEST::waaL质粒将在肠炎沙门氏菌3934vac和3934vac sb13::clyA-fiberFAdV菌株中进行电穿孔，在42℃下的生长及之后在28℃下的切除促使其整合。

·通过带有结构外部的寡核苷酸SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的PCR验证通过双同源重组的waaL基因的缺失。

7.肠炎沙门氏菌的重组禽类疫苗，其中包含带有AVA-I纤维基因序列和waaL基因缺失的肠炎沙门氏菌3934vac经过修改的突变株。

8.肠炎沙门氏菌3934vac突变株，其中包含表达盒SEQ ID NO：21和通过序列SEQ IDNO：8的存在验证的waaL的缺失。

9.肠炎沙门氏菌3934vac的突变株，其中包含序列SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：8。