[发明专利]利用设计DNA重组酶遗传改变基因组的方法与手段

权利要求书

1.用于鉴别序列的方法，所述序列是DNA重组酶的潜在靶位点，所述DNA重组酶能够诱导基因组中感兴趣序列的位点特异性DNA重组，所述方法包括以下步骤：

i.筛选包含所述感兴趣序列的所述基因组或其一部分以选出作为潜在间隔序列的两个序列，所述潜在间隔序列的长度为至少5bp且最多12bp，其中所述潜在间隔序列中的一个位于所述感兴趣序列的上游，而另一个位于所述感兴趣序列的下游，以及其中所述两个序列具有100kb的最大距离和150bp的最小距离，

ii.通过对于每个潜在间隔序列确定在其一侧形成潜在第一半位点的相邻核苷酸、优选10至20个核苷酸，以及在其另一侧形成潜在第二半位点的相邻核苷酸、优选10至20个核苷酸、更优选12至15个核苷酸，来鉴别潜在靶位点，两个潜在半位点和其间的间隔序列形成潜在靶位点，

iii.对步骤ii.中鉴别的所述潜在靶位点进行进一步筛选以选出不会出现在宿主的基因组中(其它地方)的潜在靶序列，以确保序列特异性缺失。

2.用于制备设计DNA重组酶的方法，所述设计DNA重组酶能够通过重组基因组中天然存在的两个靶序列来诱导位点特异性DNA重组以改变所述基因组中的核苷酸序列，所述方法包含：

a)选择在待改变的核苷酸序列上游的核苷酸序列作为第一靶位点，并且选择在所述待改变的核苷酸序列下游的核苷酸序列作为第二靶位点，所述靶位点的序列是不相同的，其中每个靶位点包含分别具有10至20个核苷酸的第一半位点和第二半位点，所述第一半位点和第二半位点由具有5至12个核苷酸的间隔序列隔开，

其中权利要求1的步骤在步骤a)之前进行或者作为步骤a)的一部分进行，

b)使用包含在步骤a)中选择的所述第一靶位点和所述第二靶位点的载体作为底物，在DNA重组酶的至少一个文库上应用分子定向进化，

直到获得在a)中选择的所述第一靶位点和所述第二靶位点上有活性的至少一种设计DNA重组酶。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述DNA重组酶适用于缺失，并且所述(潜在)间隔序列是相同的。

4.权利要求1或2所述的方法，其中所述DNA重组酶适用于置换，并且所述(潜在)间隔序列是不相同的。

5.用于制备设计DNA重组酶的方法，所述设计DNA重组酶能够通过重组基因组中天然存在的两个靶序列来诱导位点特异性DNA重组以置换所述基因组中的核苷酸序列，所述方法包含：

a)选择在待改变的核苷酸序列上游的核苷酸序列作为第一靶位点，并且选择在所述待改变的核苷酸序列下游的核苷酸序列作为第二靶位点，所述靶位点的序列是不相同的，其中每个靶位点包含分别具有10至20个核苷酸的第一半位点和第二半位点，所述第一半位点和第二半位点由具有5至12个核苷酸的间隔序列隔开，

b)使用包含在步骤a)中选择的所述第一靶位点和所述第二靶位点的载体作为底物，在DNA重组酶的至少一个文库上应用分子定向进化，其中步骤b)在存在包含所述第一靶位点和所述第二靶位点的合成序列的情况下进行，以选择所述载体与所述合成序列之间的重组。

直到获得在a)中选择的所述第一靶位点和所述第二靶位点上有活性的至少一种设计DNA重组酶。

6.权利要求1至5之一所述的方法，其中所述待改变的核苷酸序列是包含突变，特别是点突变、移码突变、缺失或插入的序列。

7.权利要求1至6任一项所述的方法，其中步骤b)中使用的所述载体是表达载体，所述表达载体编码DNA重组酶的至少一个文库，并且包含位于所述第一靶位点与所述第二靶位点之间的负选择标记，更优选至少一个独特的限制酶识别位点。

8.权利要求5至7任一项所述的方法，用于制备适用于置换的设计DNA重组酶，其中所述合成序列包含位于所述第一靶位点与所述第二靶位点之间的正选择标记。