[发明专利]与CA-IX阳性外来体捕获有关的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及通过使用抗CA‑IX抗体的免疫捕获来分离肿瘤来源的外来体的方法，涉及定量来自这些分离的外来体的肿瘤相关的核酸序列的方法并且涉及体外确定受试者中肿瘤存在的方法。本发明还涉及用于在这些方法中使用的试剂盒。

本发明涉及通过使用抗CA-IX抗体的免疫捕获来分离肿瘤来源的外来体的方法，涉及定量来自这些分离的外来体的肿瘤相关的核酸序列的方法并且涉及体外确定受试者中肿瘤存在的方法。本发明还涉及用于在这些方法中使用的试剂盒。

背景技术

外来体是直径30-100nm的内吞来源的膜性囊泡。它们是由几乎所有细胞类型以精细调控和功能相关的方式产生和释放的天然脂质胞外纳米囊泡，使得蛋白和核酸序列组成反映亲本(parent)细胞的类型和状况。这些囊泡具有固有的稳定性和穿过生物屏障的能力，从而可以在易于接近的生物流体，如血液中发现来源于不同组织的外来体。考虑到它们的生物学作用和特征，外来体被认为是细胞和组织体内平衡和代谢变化的早期标志，并且是识别新型疾病相关的生物标志物和在液体活组织检查范例中显示已知组织标志物的有吸引力的来源。这是在复杂疾病，如癌症的诊断中使用外来体靶向测定的主要前提和希望。主要的困难存在于将外来体相关标志物与特定组织相联系中，存在于可以在临床研究和实践中真实实现的可靠、可负担、非侵入外来体靶向溶液和测定的具体条件和优化中。

仍需要开发能够从生物样品分离肿瘤来源的外来体，并且能够以有意义的方式检测和定量肿瘤相关核酸序列的方法和相关试剂盒，肿瘤相关核酸序列如BRAF基因点突变BRAFV600E、BRAFV600K、BRAFV600R、BRAFV600M和BRAFV600D、野生型(WT)BRAF基因扩增(4，5)、KRAS基因点突变，如KRAS G12C、KRAS G12S、KRAS G12V、KRAS G12A、KRAS G12D、KRASG13D和KRAS WT基因扩增(6)、NRAS基因点突变，如NRAS G12C和NRAS G12D、NRAS Q61K、NRASQ61R(7，8)、表皮生长因子受体(EGFR)基因点突变，如EGFRT790M、EGFR L858R、EGFR外显子19缺失、EGFR外显子20缺失(9，10)、c-Myc基因扩增和过表达(11，12)、逆转录转座子RNA转录本，如短和长散在核元件(SINE，LINE)和人内源反转录病毒重复(HERV)(12)、雄激素受体(AR)基因点突变，如AR L702H、AR W742C、AR H875Y、AR F877L、AR T878A、剪接变体AR-V7和AR WT基因扩增(13-15)。

在先技术

碳酸酐酶IX(CA-IX)是已知具有诊断和预测价值的肿瘤生物标志物并且是抗癌药物开发的潜在靶标(1-2)。可以在癌症患者血清中检测CA-IX的可溶形式(3)。

WO2012115885作为可以从外来体测量的生物标志物提及了CA-IX。Dorai(16)描述了当迫使过表达CA-IX时，肾癌细胞如何提高外来体的脱落。

无论是单克隆还是多克隆，抗CA-IX抗体抗多种物种，如人、大鼠或小鼠，并且可商购自(例如)ThermoFisher Scientific Inc.。

附图说明

图1显示了通过常规沉淀或者通过使用包括CA-IX在内的多种抗体的免疫捕获从分离自V600E阳性患者血浆的外来体所测量的BRAF和BRAFV600E水平。

图2A和图2B显示了通过使用抗CA-IX抗体的免疫捕获或者通过常规沉淀，在分离自健康人、结肠直肠癌或黑素瘤患者的血浆的外来体中所测量的BRAF基因水平。

图2C显示了如通过使用抗CA-IX抗体的免疫捕获或者通过常规EV沉淀，从分离自前列腺癌患者血浆的外来体所测量的AR T878的等位基因频率。

图3显示了通过使用抗CA-IX抗体的免疫捕获或者使用抗EPCAM抗体的免疫捕获，在分离自健康人或结肠直肠癌患者血浆的外来体中所测量的BRAF基因水平。