[发明专利]用于冷冻电子显微镜的气相样品制备

说明书

本发明提供在基体上可控地形成无定形冰和其他无定形固体的层的方法，还提供利用真空下无定形的冰和其他固体形成的冷冻电子显微镜(cryo‑EM)样品制备方法和系统。无定形固体层的形成可独立于待使用电子显微镜分析的样品分子的沉积，并允许产生均匀厚的层。任选地，质谱仪器用于产生和纯化沉积于所产生的无定形固体层上的分子。本文所述的技术和系统可实现接近理想的cryo‑EM样品制备，从而大幅提高cryo‑EM蛋白成像的分辨率、灵敏度、范围和通量，因此极大地影响结构生物学领域。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的GM118110的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年7月7日提交的美国临时专利申请编号62/529,778的优先权，在不与本公开内容相抵触的程度上通过引证将其纳入本文。

发明背景

X射线晶体学传统上是为生物学研究提供结构分析的标准，虽然X射线晶体学仍提供高分辨率的结构信息，但是该技术具有一些缺点。其局限之一为X射线晶体学需要大量的样品。这使得X射线晶体学在难以产生大量、高纯度目标分子的情况下并不实用。

单颗粒冷冻电子显微镜(cryo-EM)正在成为对真核细胞、蛋白质(150kDa)和大分子复合物(例如脂质体、细胞器和病毒)结构研究的有力替代方法(Stark等人，Microscopy,2016,65(1):23-34))。冷冻电子显微镜是独特的，提供非晶体样品的3D结构信息，同时也常常需要比X射线晶体学更少的样品量。随着新型电子检测器的发展和软件图像重建的进步，冷冻电子显微镜已接近原子级分辨率，使得许多新的生物学发现成为可能。这项技术引起了人们相当大的兴趣，但它仍然存在许多局限性，包括仍然比理论上可行的低四倍的分辨率(Glaeser,R.M.,Nature Methods,2016,13(1):28-32)。大多数局限是由于样品制备导致，样品制备通常需要纯化和玻璃化。将样品包裹于玻璃态冰(即无定形冰)中有助于保护样品免受电子显微镜带来的辐射损伤。理想的样品玻璃化包括使用无定形冰层，其厚度刚好足以容纳感兴趣的颗粒。

然而，实际上，样品玻璃化的过程远非理想。典型的样品制备技术包括蛋白质分析物于水中的溶解，然后将其移液至亲水性EM网格上。用滤纸将网格吸干(除去99.99％的样品)，然后将其插入冷冻剂浴中，从而将剩余的水/样品玻璃化。从电子显微镜结构中获得正确的3D数据的关键部分为，所述颗粒必须全部具有相同的结构构象，但必须在无定形冰中随机取向。正确的3D分析通过大量图像的重建来完成，因此需要以相同结构构象随机取向的大量颗粒。遗憾的是，当前现有的样品制备技术赋予了优选的颗粒取向(很大程度上是由于颗粒向空气/水交界面的迁移)，并且颗粒经常在空气-水交界面处变形/拉伸，从而破坏了所需的结构异质性。样品对EM网格基体的吸收也会产生类似的变形。在许多情况下，成像的结构异质性在自然界中是不存在的，并且在没有分离多个构象的方法的情况下，常常无法使用冷冻电子显微镜来获得3D信息(Glaeser,R.M.,Nature Methods,2016,13(1):28-32；和Yu等人，J.Structural biology,2014,187:1-9)。