[发明专利]使用珠寡核苷酸的MDA

说明书

提供了改善的多重置换扩增(MDA)试剂和方法。

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2017年6月20日提交的美国临时专利申请号62/522,226的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

多重置换扩增(MDA)是一种非基于PCR的DNA扩增技术，涉及使用在DNA样品上随机位置引发的随机寡核苷酸。在许多情况下，随机寡核苷酸是与DNA退火的随机六聚体引物。然后在恒定温度下用聚合酶，例如链置换聚合酶例如Φ29DNA聚合酶延伸引物。然后可以对得到的延伸产物进行测序和比对，以产生DNA序列。单细胞全基因组MDA的示例在例如Spits等，Nature Protocols 1，1965-1970(2006)中描述。

发明概述

在一些方面，提供了一种进行多重置换扩增的方法。在一些实施方式中，该方法包括，

提供多个寡核苷酸，每个寡核苷酸包含至少四个连续核苷酸的3′随机序列，条形码序列，和任选的间插序列，将寡核苷酸退火至与条形码序列，间插序列互补，或同时与条形码序列和间插序列互补的互补核酸，其中所述互补核酸不与3′随机序列互补，留下3′随机序列为单链；

在使互补核酸退火至寡核苷酸并允许3′随机序列退火至样品DNA的条件下使多个寡核苷酸与样品DNA接触；和

用链置换聚合酶以模板依赖性方式延伸3′随机序列，以产生包含与DNA互补的3′序列的延长的寡核苷酸。

在一些实施方式中，多个包含具有不同随机序列的至少25个不同寡核苷酸。

在一些实施方式中，寡核苷酸还包含5’标签序列。在一些实施方式中，标签序列长2-40个核苷酸。

在一些实施方式中，寡核苷酸缺少间插序列，并且互补核酸与条形码序列或其至少6个核苷酸的连续部分互补。在一些实施方式中，条形码序列是不连续的，并且间插序列在条形码序列的两个或更多个部分之间。

在一些实施方式中，互补核酸不包含与条形码序列互补的序列。

在一些实施方式中，寡核苷酸共价连接至互补核酸的分开的拷贝，使得寡核苷酸形成多核苷酸发夹。

在一些实施方式中，互补核酸不与寡核苷酸共价连接。在一些实施方式中，5’标签序列与固体支持珠共价连接。

在一些实施方式中，该方法在(多个)分区中进行。在一些实施方式中，分区平均包含1-3个固体支持珠。在一些实施方式中，分区是乳液内的液滴。

在一些实施方式中，该方法进一步包括在延伸之后，将分区的内容物合并成大块(bulk)反应混合物。

在一些实施方式中，互补核酸包含与链置换聚合酶不相容的一个或多个核苷酸。在一些实施方式中，一个或多个核苷酸是一个或多个尿嘧啶。在一些实施方式中，所述一个或多个核苷酸被生物素化。在一些实施方式中，生物素化的核苷酸与链霉亲和素结合。

在一些实施方式中，链置换聚合酶是Φ29聚合酶。

在一些实施方式中，随机序列长4-10个核苷酸。

在一些实施方式中，条形码序列长8-50个核苷酸。

在一些实施方式中，间插序列长6-40个核苷酸。

在一些实施方式中，该方法包括提供包封在水凝胶珠中的样品DNA，将水凝胶珠定位在含寡核苷酸中至少一个的液滴中，并从水凝胶中释放样品DNA，从而使寡核苷酸与样品DNA接触。在一些实施方式中，水凝胶中的样品DNA由来自一个或多个细胞的DNA组成。在一些实施方式中，该方法包括：将一个或多个细胞包封在水凝胶珠中，裂解一个或多个细胞，以及任选地使裂解的细胞与一种或多种蛋白酶接触；和从水凝胶珠中分离出从水凝胶珠中扩散出来的细胞裂解产物。