[发明专利]对未孵化卵中的禽类胚胎进行性别确定的方法及其用具

权利要求书

1.一种对在结构完整的卵壳内包含胚胎的未孵化的卵中的禽类胚胎进行性别确定的方法，所述方法包括以下步骤：

（a）提供至少一个转基因雌性禽类受试对象，其包含整合到雌性染色体Z和W中至少一者内的至少一个位置或部位中的至少一种外源报告基因，其中所述报告基因是红色荧光蛋白（RFP）；

（b）从所述转基因雌性禽类受试对象获得至少一个在结构完整的壳内包含胚胎的未孵化的卵；以及

（c）确定在所述未孵化的卵的所述结构完整的壳内的所述胚胎中是否检测到至少一种可检测信号，其中检测到所述至少一种可检测信号则表明所述未孵化的卵的所述结构完整的壳内的所述胚胎中的所述至少一种报告基因的表达，从而表明在所述胚胎中存在所述Z染色体或W染色体，

从而对在结构完整的壳内包含胚胎的未孵化的卵中的禽类胚胎的性别进行确定。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告基因编码具有500-650nm的激发波长和550-650nm的发射波长的RFP蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定是否检测到可检测信号包括将所述在结构完整的壳内包含胚胎的未孵化的卵置于光源下的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种报告基因被整合到所述转基因雌性禽类受试对象的染色体Z的至少一个位置中，从而检测到可检测信号表明在所述在结构完整的壳内包含胚胎的未孵化的卵中的所述胚胎是雄性。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种报告基因被整合到所述转基因雌性禽类受试对象的染色体W的至少一个位置中，从而检测到可检测信号表明在所述在结构完整的壳内包含胚胎的未孵化的卵中的所述胚胎是雌性。

6.根据权利要求1所述的方法，其中使用至少一种可编程的工程化核酸酶（PEN）将所述至少一种报告基因整合到所述转基因雌性禽类受试对象的性别染色体中。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述PEN是成簇的规律间隔的短回文重复（CRISPR）II型系统。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，通过由至少一种CRISPR/CRISPR相关核酸内切酶9（Cas9）系统所介导的同源性定向修复（HDR）将所述至少一种报告基因整合到所述转基因雌性禽类受试对象的所述性别染色体中。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使所述雌性禽类受试对象的至少一种细胞或引入所述雌性禽类受试对象的至少一种细胞接触或共转染：

（a）至少一种Cas9蛋白或包含编码所述至少一种Cas9蛋白的至少一种核酸序列的至少一种第一核酸序列；以及靶向在至少一个性别染色体Z和/或W中的至少一个原间隔序列的向导RNA（gRNA），或编码所述至少一种gRNA的至少一种核酸序列；和

（b）包含至少一种所述报告基因的至少一种第二核酸序列，

将所述至少一种报告基因整合到所述转基因雌性禽类受试对象的性别染色体中。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述第二核酸序列中的所述至少一种报告基因在其5'和3'处侧接有用于在整合位点处HDR的同源臂。

11.根据权利要求9所述的方法，其中在所述第二核酸序列中的所述至少一种报告基因与性别特异性启动子、胚胎特异性启动子和诱导型启动子中的任一者可操作地连接。

12.根据权利要求9所述的方法，其中将所述至少一种报告基因整合到所述性别染色体的至少一个非编码区中。

13.根据权利要求12所述的方法，其中将所述至少一种报告基因整合到性别Z染色体基因座42172748-42177748的至少一个位点中。