[发明专利]用于调节T细胞功能的反义寡核苷酸

说明书

本发明涉及用于调节T细胞功能的反义寡核苷酸，包括与IFN‑γ、颗粒酶、穿孔素1、PD‑1、PRDM1、PD‑L1、CD40LG、NDFIP1、PDCD1 LG2、REL、BTLA、CD80、CD160、CD244、LAG3、TIGIT、ADORA2A和TIM‑3 RNA杂交的反义寡核苷酸。特别地，本发明涉及能够诱导RNA的外显子跳读的反义寡核苷酸。本发明还要求保护通过提供T细胞受体基因进一步修饰所述T细胞特异性的方法。

本发明涉及反义寡核苷酸。具体地说，本发明涉及能够诱导外显子跳读(exonskipping)的反义寡核苷酸。更具体地，本发明涉及此类反义寡核苷酸在免疫治疗领域，特别是针对肿瘤和/或病毒感染(例如乙型肝炎引起的肝细胞癌、EBV引起的NKT细胞淋巴瘤和其它慢性感染，例如慢性HBV感染和人巨细胞病毒感染)的免疫治疗中的用途。

此处显示，T细胞表达的免疫相关或免疫调节基因的直接和选择性下调(例如，通过反义寡核苷酸(ASO)介导的外显子跳读或内含子保留)可导致T细胞功能的调节(例如增强的扩增、杀伤能力或产生抗病毒细胞因子的能力)。

“科学”杂志已将癌症免疫疗法宣布为“2013年的突破”[1]。一些正在进行的有希望的临床试验和承认新模式转变的希望证明了编辑人员所作的陈述：该疗法现在针对的是免疫系统，而非肿瘤[2]。各种其它方法的失败以及将“免疫逃逸”定义为癌症新标志的新发现都支持这种策略的改变。事实上，该领域的新进展表明免疫系统在监视和消灭肿瘤方面积极发挥作用，由于癌细胞表面经常具有可能被检测得到的修饰分子(肿瘤相关抗原)，从而导致它们被消除。然而，癌症通常能够逃避检查或使得免疫反应沉默。因此，恢复功能和及时的免疫抗肿瘤活性可以改善长期未得到解决的抗癌斗争。

免疫疗法的第一种方法是给予能够刺激免疫系统的细胞因子(例如IL-2)，而如今，过继性T细胞转移和免疫检查点阻断已被广泛采用[3]。过继性T细胞转移是向患者体内施用经工程改造的淋巴细胞，工程改造过程旨在针对肿瘤相关抗原的T细胞活化和/或重定向。各种概念验证研究已经揭示了工程改造的T细胞在过继转移治疗中的潜力，关键的构思在于通过抗原受体基因的转移来重定向T细胞特异性。在过去的几十年中很少开发这样的策略，它们涉及常规T细胞受体(TCR)的重组变体，或与跨膜和激活域连接的抗体样受体链的复合物(CAR)[4]。

嵌合抗原受体(CAR)由三个功能单元组成：用于抗原识别的胞外域、跨膜锚定域和胞内信号传导域[5]。第一个是抗体样单链，其主要优点是抗原结合的强度(比常规T细胞受体高很多倍)，并且识别不受HLA限制或不依赖于抗原呈递细胞(APC)上的抗原呈递途径。相反，信号传导域源自CD3f的元件与共刺激域的组合。在过去的几十年中，CAR有了长足的进展，许多研究正在进行中，并给出令人鼓舞的结果；然而，目前仅鉴定了少数特异性靶标，此外，这些受体可能因它们的非生理特性而是免疫原性的。

用于过继免疫治疗的T细胞受体(TCR)由生理αβ异源二聚体构成，其经过工程改造以避免与内源性TCR链二聚化，并且与CD3复合物的信号传导元件一起表达[6]。TCR结合与MHC-I(主要组织相容性复合物-I)分子组合并在其表面呈递的抗原。这种方法仅限于这样的环境，其中针对MHC-1/肽复合物的TCR已从抗原特异性T细胞中分离并进行表征，并且它依赖于癌细胞的呈递途径。然而，与CAR相比，TCR具有非免疫原性的生理结构，并且其体内活性在生理条件下是已知的。

在慢性乙型肝炎或乙型肝炎病毒(HBV)相关的肝细胞癌(HCC)的情况中，过继性T细胞疗法已显示出积极的成果。具体地说，用表达HLA限制性HBV特异性TCR的病毒载体转导的T细胞能够识别衍生自与MHC-1分子一起呈递的病毒的核心和包膜蛋白的肽[7]。该识别诱导了HBV特异性T细胞的激活，从而导致HBV感染细胞的裂解。此外，相同的细胞已成功用于HBsAg阳性HCC复发的患者[8]。在患者体内输注的HBV特异性TCR重定向T细胞能够在体内增殖，体外测试证实了它们的特异性和激活状态。治疗4周后，免疫疗法诱导HBsAg水平下降，同时T细胞趋化因子和ALT(丙氨酸转氨酶，肝细胞裂解的标志物)增加。