[发明专利]使用的水凝胶珠和流动池的遗传物质的空间索引和文库制备

说明书

提供了用于在测序流动池的表面上播种序列文库的方法的实施方式，其允许文库在表面上的空间隔离。空间隔离可用于索引来自各个测序文库的序列读出，以提高后续数据分析的效率。在一些示例中，容纳包封的测序文库的水凝胶珠被捕获在测序流动池中，并在液体扩散屏障的存在下降解，以允许测序文库在流动池的表面上进行空间隔离和播种。另外，提供了与配置用于核酸文库制备和单细胞测序的流动池设备有关的系统、方法和组合物的示例。一些示例包括流动池设备，其具有其中装有遗传物质的水凝胶，并且在核酸加工期间将其保留在水凝胶内。

相关申请

本专利申请要求于2018年4月26日提交的美国临时专利申请号62/663,129和2017年8月1日提交的美国临时专利申请号62/539,949的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

背景技术

边合成边测序(SBS)技术提供高质量的测序数据。但是，SBS方法可能受序列读出长度的限制，因为在某些情况下，SBS测序读出的长度不超过300个核苷酸。SBS技术的短读长度可能涉及大量数据分析，以从SBS程序期间生成的多个重叠的短序列读出进行对齐和重建长核酸序列。预测序步骤(例如对特定核酸分子进行加条形码编码)可以简化数据分析，但也会增加SBS方法的复杂性。

发明内容

本文提供了用于在测序流动池上播种由遗传物质(例如靶核酸分子或含有靶核酸分子的细胞或细胞裂解物)产生的测序文库的方法的示例，其允许在流动池上各个文库的空间隔离。空间隔离可用于索引来自各个测序文库的序列读出，以提高后续数据分析的效率。测序文库的这种“空间索引”允许简化从中产生测序文库的遗传物质的处理和序列重建。在其他改进中，所公开的方法可以减少并且在某些情况下甚至消除对用于识别与特定遗传物质有关的序列读出的繁琐条形码步骤的需要。本文所述的示例还增加了用于靶核酸分子测序的数据分辨率，并进一步简化了基因组的组装(例如对于新的生物)，并提供了对罕见基因变异和靶核酸分子中突变共现的改进识别。

在一些示例中，提供了一种方法，其包括在足以将水凝胶珠捕获在测序流动池的表面上的条件下，将可降解水凝胶珠加载到测序流动池上。在一些示例中，可降解水凝胶珠容纳由包封的遗传物质制备的测序文库。在一些示例中，可降解水凝胶珠容纳包封的遗传物质，并且该方法进一步包括在所捕获的可降解水凝胶珠中从遗传物质制备测序文库。然后将包围所捕获的水凝胶珠的液体扩散屏障加载到测序流动池上，并在存在液体扩散屏障的情况下降解所捕获的水凝胶珠，以允许将测序文库转运和播种到测序流动池的表面上。

遗传物质可以是例如靶核酸分子，例如基因组DNA(例如人基因组DNA)，以及含有靶核酸分子的细胞和细胞裂解物。

在一些示例中，测序文库包含长度为至少150个核苷酸的DNA或RNA。

在一些示例中，液体扩散屏障是油、例如矿物油、硅酮油或全氟化油、或其两种或更多种的组合。在一些示例中，液体扩散屏障是粘稠水溶液，例如包含聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮、普罗尼克葡聚糖、蔗糖、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEO-PPO-PEO)/锂皂土、或两种或多种的组合。

在一些示例中，可降解水凝胶珠通过下述中的一种或多种降解：(a)与剪切可逆交联剂的试剂接触，所述交联剂将水凝胶的聚合物交联(例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、三(3-羟基丙基)膦(THP)或两种或多种的组合)；(b)加热至90℃左右；以及(c)将水凝胶珠暴露于剪切光可剪切交联剂的波长的光下，所述交联剂将水凝胶的聚合物交联。

在一些示例中，所述水凝胶珠的直径为约5μm至约120μm。

在一些示例中，所述水凝胶珠是包含容纳遗传物质的中空核的中空水凝胶珠。

水凝胶珠包含直径尺寸足够大的孔，以允许试剂扩散通过珠，同时在水凝胶珠中保留包封的遗传物质和测序文库。在一些示例中，孔的直径为约10nm至约100nm。