[发明专利]使用分割型脱氨酶限制不需要的脱靶碱基编辑器脱氨

权利要求书

1.一种融合蛋白，其包含：

(i)与可编程DNA结合结构域融合的第一分割型脱氨酶部分(sDA1)酶、和任选地一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)序列，所述可编程DNA结合结构域选自由锌指(ZF)、转录激活子效应子样效应子(TALE)、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)Cas RNA指导的核酸酶(RGN)、无催化活性的Cas9(dCas9)、产生切口的Cas9(nCas9)组成的组，其中sDA1是选自由hAID、rAPOBEC1、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、hAPOBEC3H及其变体组成的组的亲本脱氨酶的N端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；或

(ii)第二分割型脱氨酶部分(sDA2)，其与nCas9、和一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)蛋白、或如用于其互补性sDA1部分的任何正交DNA靶向性结构域融合，其中sDA2是hAID、rAPOBEC1*、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、hAPOBEC3H及其变体的C端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；

其中(i)的融合蛋白与(ii)的融合蛋白在真核细胞中的共表达以及它们其后在邻近基因组靶位点处的共定位提供具有催化活性的碱基编辑器。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白对，其包含：

(i)第一融合蛋白，其包含与一个或多个ZF融合的第一分割型脱氨酶部分(sDA1)酶、和任选地一个或多个UGI序列，其中sDA1是选自由hAID、rAPOBEC1、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G或hAPOBEC3H及其具有改变的底物特异性或活性的变体组成的组的亲本脱氨酶的N端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；和

(ii)第二融合蛋白，其包含与nCas9蛋白和一个或多个UGI蛋白融合的第二分割型脱氨酶部分(sDA2)，其中sDA2是与SDA1相同的亲本脱氨酶的C端截短、无催化活性或缺陷型衍生物，

其中(i)的融合蛋白与(ii)的融合蛋白在真核细胞中的共表达以及它们其后在邻近基因组靶位点处的共定位提供具有催化活性的碱基编辑器。

3.一种核酸，其编码根据权利要求1所述的融合蛋白。

4.一种组合物，其包含一种或多种核酸，其中所述核酸编码根据权利要求2所述的融合蛋白对。

5.一种使核酸中一个或多个所选胞嘧啶靶向性脱氨的方法，所述方法包括使所述核酸与根据权利要求2所述的融合蛋白对、以及一种或多种与所述融合蛋白中的Cas9结构域相互作用的gRNA接触，优选其中所述融合蛋白之一包含nCas9，另一融合蛋白包含ZF或TALE，所述ZF或TALE靶向与针对nCas9的gRNA的靶位点邻近的9-24bp序列，其中gRNA与包含所述所选胞嘧啶的核酸结合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸在细胞中，并且所述方法包括使所述细胞与所述融合蛋白接触或在所述细胞中表达所述融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。

8.一种改进细胞中靶向性脱氨的特异性的方法，所述方法包括在所述细胞中表达、或使所述细胞接触：根据权利要求2所述的融合蛋白对、以及一种或多种与所述融合蛋白中的Cas9结构域相互作用的gRNA，优选其中所述融合蛋白之一包含nCas9，另一融合蛋白包含ZF或TALE，所述ZF或TALE靶向与针对nCas9的gRNA的靶位点相邻的9-24bp序列，其中所述gRNA与包含所选胞嘧啶的核酸结合。

9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其中所述融合蛋白以下列形式递送：一种或多种与所述融合蛋白中的Cas9结构域相互作用的gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体、mRNA或质粒。