[发明专利]用于改良刺糖多孢菌的高通量(HTP)基因组工程改造平台

权利要求书

1.一种使糖多孢菌属微生物进化以获得所期望表型的高通量(HTP)基因组工程改造方法，其包含：

a.扰动具有相同基因组菌株背景的初始多种糖多孢菌微生物的基因组，由此创建包含具有独特基因变异的个别糖多孢菌菌株的初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库；

b.针对所期望表型筛选和选择所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株；

c.提供各自包含独特基因变异组合的后续多种糖多孢菌微生物，所述基因变异选自前一步骤中所筛选的至少两种个别糖多孢菌菌株中所存在的所述基因变异，由此创建后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库；

d.针对所期望表型筛选和选择所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株；和

e.按照线性或非线性方式重复步骤c)-d)一次或多次，直到糖多孢菌微生物已获得所期望表型为止，其中每次后续迭代创建了新的HTP基因设计糖多孢菌菌株文库，所述新的HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含具有独特基因变异的个别糖多孢菌菌株，所述独特基因变异是选自前一HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的至少两种个别糖多孢菌菌株的基因变异组合。

2.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中在步骤(b)中组合所述基因变异之前，不考虑含有所述基因变异的所述基因的功能和/或特性。

3.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中待组合的至少一种基因变异不在含有编码DNA模块的重复区段的基因组区域内。

4.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中通过以下产生步骤(c)中各自包含独特基因变异组合的所述后续多种糖多孢菌微生物：

1)将质粒引入到属于所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库的个别糖多孢菌菌株中，其中所述质粒包含选择标记；反向选择标记；与基本糖多孢菌菌株的基因组基因座具有同源性的DNA片段；及质粒骨架序列，其中所述DNA片段具有源自也属于所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库的另一个别糖多孢菌菌株的基因变异；

2)基于所述基因组中存在所述选择标记选择具有整合事件的糖多孢菌菌株；

3)基于不存在反向选择标记基因选择质粒骨架环出的糖多孢菌菌株。

5.根据权利要求4所述的HTP方法，其中所述质粒不包含温度敏感型复制子。

6.根据权利要求4所述的HTP方法，其中在不复制整合质粒的情况下执行选择步骤(3)。

7.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含至少一个选自由以下组成的群组的文库：启动子交换微生物菌株文库、SNP交换微生物菌株文库、起始/终止密码子微生物菌株文库、优化序列微生物菌株文库、终止子交换微生物菌株文库、转座子诱变微生物菌株多样性文库、核糖体结合位点微生物菌株文库、抗代谢物/发酵产物抗性文库、终止插入微生物菌株文库和其任何组合。

8.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库是所述初始HTP基因设计微生物菌株文库的完整组合糖多孢菌菌株文库。

9.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库是所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的所述基因变异所衍生的完整组合糖多孢菌菌株文库的子集。

10.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中菌株文库中的所述基因变异所衍生的所述后续HTP基因设计是前一HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的所述基因变异所衍生的完整组合微生物菌株文库。

11.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库是前一HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的所述基因变异所衍生的完整组合糖多孢菌菌株文库的子集。