[发明专利]聚山梨醇酯的定量分析

说明书

本发明涉及一种定量样品中聚山梨醇酯的方法，包括以下步骤：a)提供包含至少一种聚山梨醇酯的样品；b)将样品与羰花青染料混合；c)测定混合物的荧光；及d)将荧光与聚山梨醇酯的含量相关联。

背景技术

聚山梨醇酯是一类非离子型表面活性剂，在药品和食品工业中广泛用作赋形剂。聚山梨醇酯20(PS20)和聚山梨醇酯80(PS80)-亦称为吐温20(20)和吐温80(80)-是最常用的表面活性剂，用于防止治疗蛋白吸附到界面和相关的不稳定情况。PS20和PS80在生物药品中对蛋白质稳定性的贡献得到了广泛认可，它们都是监管机构批准的肠胃外给药赋形剂。大多数包含肽、蛋白质、抗体和疫苗的生物制药产品都采用聚山梨醇酯配制。例如，大约80％的商业单克隆抗体(MAb)都含有PS20或PS80。它们较高的亲水亲油平衡值(HLB)及较低的临界胶束浓度(CMC)使它们即使在低浓度下也具有非常高的表面活性。生物药品中聚山梨醇酯的典型浓度是0.001-0.1％(w/v)，对应于0.01-1mg/ml。

虽然人们对其稳定作用的分子详细情况尚未完全了解，但众所周知的是聚山梨醇酯通过两种不同的机制稳定蛋白质，即(i)竞争吸附到疏水界面上和/或(ii)直接与蛋白质结合。在第一种机制中，与蛋白质相比，聚山梨醇酯每单位面积的吸附能量更大，从而与蛋白质有效竞争，防止其吸附到疏水界面上。此外，聚山梨醇酯可以与蛋白质直接相互作用，通过与暴露的疏水区结合及保护暴露的疏水区而提高其在溶液中的稳定性。这样通过减少蛋白质-蛋白质之间的相互作用，防止蛋白质聚集。对具体的蛋白质的稳定来说，这两种机制中哪种机制占主导作用取决于蛋白质及聚山梨醇酯。

聚山梨醇酯具有两亲性结构。它们的亲水性级分包含脱水山梨糖醇头部基团，每个羟基与聚乙二醇链(PEG/聚氧化乙烯链/POE)结合。疏水性部分的特点是其羟基被酯化的脂肪酸(FA)。从理论上来说，不同的聚山梨醇酯可以通过那些脂肪酸区分。实际上，商业聚山梨醇酯包含结构上相关的分子，仅大约20％(w/w)的聚山梨醇酯材料与理论分子结构相符。

除合成期间形成的副产物之外，降解反应(氧化和水解)可能也是聚山梨醇酯溶液不均匀的原因。聚山梨醇酯降解产物的形成会导致制剂内表面活性剂浓度损失。

除此之外，它们还可能丧失表面活性剂性质。这可能影响蛋白质的稳定性，并且会导致形成蛋白质聚集体和颗粒。因此，必须防止降解反应。聚山梨醇酯的降解综述及它们的降解分析见Martos,A.et.al.；Journal of Pharmaceutical Sciences；2017；doi:10.1016/j.xphs.2017.03.001。

由于对治疗蛋白制剂中聚山梨醇酯的浓度及聚山梨醇酯的降解进行监测是非常重要的，因此，人们已经开发了几种分析样品中聚山梨醇酯含量及其降解产物含量的方法。通常，在脱除蛋白质(例如，通过有机溶剂使蛋白质沉淀或通过固相萃取)的样品制备后，使样品通过反相液相色谱(RP-HPLC)，从而分离样品的各组分(聚山梨醇酯)，并采用质谱、ELSD或CAD检测对它们进一步进行分析。此外，聚山梨醇酯80可以在水解释放出油酸后，采用紫外/可见光(UV/Vis)检测。这些方法中的大多数方法比较复杂、耗时长，并且对蛋白质干扰比较敏感。接下来，是采用这种荧光染料法进行定量。最常见的分析方法是基于N-苯基-1-萘胺(NPN)的荧光胶束分析(FMA)，这种方法依据的是荧光染料与特别是超过CMC的胶束中存在的疏水环境之间的相互作用。这种分析方法的缺点是缺乏PS的特异性(即NPN可能与蛋白质、硅油相互作用，而且可能受到溶液粘度的影响)，并且PS的定量仅在浓度超过CMC时才可行。

因此，本发明的目的是提供能够快速理想地自动或半自动检测和定量聚山梨醇酯的新方法。

发明内容

本发明人惊讶地发现，样品中聚山梨醇酯的含量可以采用羰花青染料，特别是选自1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)或其衍生物DID(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青4-氯苯磺酸盐)和DiO(3,3'-双十八烷基氧代羰花青高氯酸盐)的羰花青染料准确地定量。