[发明专利]低温保存

说明书

本发明提供一种用于治疗或药理测试目的细胞化支架的低温保存的方法和材料，该方法包括：(i)提供一种已在其上接种了细胞的培养支架；(ii)用包含培养基和5％～30％的低温保护剂例如DMSO的低温保存组合物平衡该细胞化支架；(iii)通过以约‑1℃/分钟的速率连续降温至约‑80℃来冷冻该平衡的细胞化支架；(iv)将该冷冻的细胞化支架保存于‑135℃～‑198℃之间的温度下。

技术领域

本发明主要涉及用于细胞化支架的低温保存的方法和材料。

背景技术

组织工程(TE)被证明是受损或患病的器官和组织的常规治疗的一种可行且重要的替代方法[1-3]。目前，各种工程器官和组织正在进行临床前试验(气管，心脏瓣膜，喉，血管，膀胱)[4，5]。

一种特别有前途的TE方法是使用脱细胞作用创建非免疫原性基质，然后将其与自体或其他相容性细胞重新细胞化。脱细胞过程使用洗涤剂和酶去除组织和器官的细胞室。重要的是，保留了支架的细胞外基质，从而保持了组织的原始结构和组成[3，4，6-8]，但避免了任何潜在的免疫排斥反应[9]。供体组织不必是人源的，但可以从解剖学上匹配的物种中获得[10]，因此有可能解决严重的供体器官短缺问题。

有关组织工程学脱细胞基质的出版物例如包括与肠[11，12]，食管[7]，肺[14]和隔膜[15]有关的组织。在一个例子中，一种组织工程化的气管使用自体干细胞制备，并被移植到一名儿童体内[5]。后来的报道表明，气管仍然是整合的，并且该工程器官随儿童一起生长，展示了TE的巨大效用[16]。

WO201742232描述了一种用于制备植入物，特别是腔组织植入物的改进方法，其中该植入物通过使用肌肉细胞前体和成纤维细胞接种无细胞支架或基质工程化，例如，使用特定比例的细胞进行注射接种。

随着组织工程应用在临床中越来越多地使用，一个主要的限制因素就是在需要时迅速提供足够数量的合适的细胞化支架的能力。能够按需提供这种“现成”工程器官可以显著增加受益于这种治疗方法的患者数量。

因此，人们希望能够预先制备再细胞化支架并以一种能充分保存该构建体的结构和功能的方式存储它们。

现有技术中已经提出了脱细胞支架或天然组织的低温保存方法。例子包括：Franchini等人，Blood Transfus.，2009年7月，100-105页；Bonenfant等人，Biomaterials，2013，34，3231-3245；Gallo等人，Heart Vessels，2016：1862-1873；Brockbank等人，CellTissue Banks，2012，13，663-671；Poornejad等人，Organogenesis，2015，11，30-45。

然而，这些支架或组织的结构和性质与细胞化支架的结构和性质不同，因此可能适用于这些无细胞支架或天然组织的方法并不能合理预期可应用于细胞化支架。

Chen等人(Biomaterials，2011，32，8426-8435)研究了海藻糖对上皮层的低温保存方法。将接种有角质细胞的壳聚糖-明胶膜使用不同的低温保存溶液(包括海藻糖，以及除海藻糖以外的一种物质)冻存，方法是将样品在4℃下放置30分钟，然后放入液氮中。通过分步冷冻(4℃下30分钟，-20℃下2小时，-80℃下过夜，然后液氮)低温保存细胞悬液。

Costa等人(组织工程，2012，18，852-858)研究了多孔支架的低温保存方法，该多孔支架是基于淀粉和聚己内酯混合物的纤维网为载体，并接种了山羊骨髓干细胞。该作者显然是直接在-196℃下的液氮中进行低温保存。