[发明专利]具有提高的敲入效率的基因编辑方法

说明书

本公开内容提供了使用具有3’悬突的单链DNA或双链DNA在细胞的基因组中靶向插入目标基因的组合物和方法。还提供了产生能够用于靶向插入的具有3’悬突的单链DNA或双链DNA的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年06月16日提交的美国临时专利申请号62/521,280的优先权，其公开内容通过引用并入本申请。

发明领域

本发明一般地涉及基因编辑的方法。

背景技术

使用经工程化改造的位点特异性核酸酶(例如，CRISPR、ZFN、TALEN)的基因编辑技术的开发为在包括人在内的高等生物中进行靶向基因修饰打开了大门，并且具有基因治疗的巨大潜力。这种基因编辑技术通常依赖于核酸酶以形成DNA双链断裂(DSB)以及细胞DNA修复机制以产生靶向突变或基因插入(即，敲入)。目标基因的精确位点特异性插入通常通过同源定向修复(HDR)途径发生，即使在存在DSB的情况下，其也具有较低的重组率。

据报道，使用单链DNA(ssDNA)提供目标基因供体能够提高通过HDR靶向插入的效率(参见例如，Quadros等人，“Easi-CRISPR:a robust method for one-step generationof mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donorsand CRISPR ribonucleoproteins.”Genome Biology(2017)18:92)。然而，长的ssDNA是不稳定的，并且通过化学合成产生的ssDNA的尺寸限制在约200个核苷酸。

因此，对开发具有提高的插入效率的新基因编辑技术存在持续的需求。

发明内容

在一个方面中，本公开内容提供了一种用于编辑细胞中的靶基因座的组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含(i)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和(ii)单链DNA(ssDNA)，所述ssDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的目标基因，其中所述ssDNA具有核酸外切酶抗性修饰。

在某些实施方式中，所述位点特异性核酸酶是Cas9、锌指核酸酶或TALEN。在某些实施方式中，所述位点特异性核酸酶是Cas9，并且所述组合物还包含导向至所述靶基因座的向导RNA。

在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰是生物素化、5’羟基、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基碱基或2’氟碱基。在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰对λ核酸外切酶、T5核酸外切酶或T7核酸外切酶具有抗性。

在另一个实施方式中，本申请提供的组合物包含(i)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和(ii)双链DNA(dsDNA)，所述dsDNA由第一DNA链和第二DNA链组成，其中所述dsDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的目标基因，其中所述第一DNA链具有在3’末端的第一单链DNA(ssDNA)悬突，并且所述第二DNA链具有在3’末端的第二ssDNA悬突。

在某些实施方式中，所述第一和第二DNA链中的每一个均具有核酸外切酶抗性修饰。在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰是生物素化、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基或2’氟碱基。在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰对λ核酸外切酶、T5核酸外切酶或T7核酸外切酶具有抗性。

在某些实施方式中，所述第一和第二ssDNA悬突中的每一个均具有5-200个核苷酸的长度。

在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于向细胞中的靶基因座插入目标基因的方法。在某些实施方式中，所述方法包括将下述引入细胞：(i)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和(ii)单链DNA(ssDNA)，所述ssDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的目标基因，其中所述ssDNA具有一种或多种核酸外切酶抗性修饰。