[发明专利]包含葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的经修饰的酵母

说明书

描述了涉及表达外源或增加量的葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的经修饰的酵母的组合物和方法。与亲本细胞相比，经修饰的酵母生产增加量的乙醇。这种酵母对于从淀粉底物大规模生产乙醇特别有用。

技术领域

本发明的组合物和方法涉及具有葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的经修饰的酵母。与在其他方面相同的酵母相比，经修饰的酵母在淀粉水解产物发酵中产生增加量的乙醇。这种酵母对于从淀粉底物大规模生产乙醇特别有用。

背景技术

第一代基于酵母的乙醇生产将糖转化为燃料乙醇。全世界酵母的年度燃料乙醇产量为约900亿升(Gombert,A.K.和van Maris.A.J.(2015)Curr.Opin.Biotechnol[生物技术现状].33:81-86)。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为所述生产量如此之大，所以甚至小的产率提升对于该产业也将具有巨大的经济影响。

生化方面，葡萄糖向乙醇和二氧化碳的转化是氧化还原中性的，最大理论产率为约51％。然而，在酵母生长过程中，存在过剩的NADH，用于生产甘油以实现氧化还原平衡和渗透保护。目前，从玉米醪液中酵母发酵的用于乙醇生产的工业产率为约45％，因此，有机会将乙醇的产率再增加10％，这可以转化为另外的九十亿升乙醇。除不可避免的二氧化碳外，酵母生物质和甘油是该发酵过程的两个主要副产物。

单糖和其他简单糖是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的首选碳和能量来源(Leandro,M.J.,等人(2009)FEMS Yeast Res[欧洲微生物学会联合会酵母研究].9:511-25)。许多单糖转运蛋白通过促进扩散而起作用，以能量独立的方式使此类分子沿细胞膜上的浓度梯度移动。其他单糖转运蛋白是耗能的，允许糖分子以浓度梯度摄取，与质子的同时运动相结合。此类转运蛋白通常仅在生长培养基中存在有限的糖时才起作用。酿酒酵母中己糖的摄取仅通过约二十种转运蛋白(包括Hxt蛋白)介导的促进扩散而发生(Lagunas,R.(1993)FEMS Microbiol.Rev[欧洲微生物学会联合会微生物学研究].10:229-42)，这些转运蛋白具有不同的动力学特性和调节方式(Reifenberger,E.等人(1997)Eur.J.Biochem[欧洲生物化学杂志].245:324-33)。糖摄取对代谢通量有重要影响(Elbing,K.D.等人(2004)Eur.J.Biochem[欧洲生物化学杂志].271:4855-64)，影响细胞生长、分解代谢抑制、发酵和呼吸(Goffrini等人(2002)J.Bacteriol[细菌学杂志].184:427-32；Barnett,J.A.和Entian,K.D.(2005)Yeast[酵母]22:835-94)。

工程化酵母实现自由能守恒是提高乙醇产率的策略之一(Gombert和van Maris,同上)。酵母的生长需要ATP形式的能量。在假设增加的糖的级分转化为乙醇而不是生物质和甘油的情况下，如果ATP的消耗可以增加，则可以提高糖的乙醇产率，因为必须将更多的糖转化为乙醇和二氧化碳以提供相同量的ATP用于细胞维持。据报道，液泡碱性磷酸酶(Ph08)的过表达提高了乙醇的产率(Semkiv,M.V.等人(2014)BMC Biotechnol[BMC生物技术].14:42)。然而，引入此类非化学计量的ATP消耗(尤其是工业应用)面临的挑战在于，在积极影响与降低的细胞稳健性之间进行微调(Gombert和van Maris,同上)。

酿酒酵母菌株已用ATP介导的蔗糖转运蛋白进行了工程化。在工程化的菌株中，质子挤出所需的ATP降低了蔗糖上的厌氧ATP产率，从而导致乙醇产率提高(Basso,T.O.等人(2011)Met.Eng[代谢工程化].13:694-703)。然而，在当前的乙醇生产工业中，在美国，蔗糖不是主要底物。

将自由能守恒的概念与增加的糖摄取联系起来以增加乙醇产率的机会仍然存在。

发明内容