[发明专利]制造双链DNA片段的方法在审
| 申请号： | 201880055170.6 | 申请日： | 2018-08-28 |
| 公开（公告）号： | CN111065737A | 公开（公告）日： | 2020-04-24 |
| 发明（设计）人： | 伊藤雄介;佐藤知香子;谷内江望 | 申请（专利权）人： | 丝芭博株式会社 |
| 主分类号： | C12N15/09 | 分类号： | C12N15/09 |
| 代理公司： | 中原信达知识产权代理有限责任公司 11219 | 代理人： | 鲁雯雯;金龙河 |
| 地址： | 日本*** | 国省代码： | 暂无信息 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 制造 dna 片段 方法 | ||
1.一种通过双重不对称PCR(DA-PCR)制造具有期望的碱基序列的双链DNA片段的方法，
其具备：
(1)准备各自相当于所述双链DNA片段的有义链的一部分的两种以上的寡核苷酸(有义寡核苷酸)和各自相当于所述双链DNA片段的反义链的一部分的两种以上的寡核苷酸(反义寡核苷酸)，将等浓度的所述各种寡核苷酸与DNA聚合酶和dNTP混合而制备反应混合液的步骤；
(2)使用步骤(1)的反应混合液进行PCR的步骤；
(3)向步骤(2)的反应混合液中添加能够扩增所述双链DNA片段的全长的引物对的步骤；和
(4)使用步骤(3)的反应混合液进行PCR的步骤，
在使所述两种以上的有义寡核苷酸和所述两种以上的反义寡核苷酸与所述双链DNA片段的有义链和反义链对应地排列的情况下，相邻的所述有义寡核苷酸彼此或相邻的所述反义寡核苷酸彼此不相互连续，交替相邻的所述有义寡核苷酸和所述反义寡核苷酸在相邻的末端部具备具有互补的碱基序列的区域(重叠区域)，所述双链DNA片段的全序列被交替相邻的所述有义寡核苷酸和所述反义寡核苷酸覆盖。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，PCR是将94～98℃下20～60秒和70～75℃下20～60秒的PCR程序重复进行2～20个循环。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，PCR是将94～98℃下20～60秒、50～65℃下5～60秒和70～75℃下20～60秒的PCR程序重复进行2～20个循环。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，步骤(4)中，PCR是将94～98℃下5～10秒、50～65℃下5～15秒和70～75℃下5～30秒的PCR程序重复进行2～30个循环。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，DNA聚合酶为选自由Pfu聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、Taq聚合酶、Phusion高保真DNA聚合酶组成的组中的DNA聚合酶。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，进一步具备：
(5)进行OE-PCR的步骤。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于丝芭博株式会社，未经丝芭博株式会社许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201880055170.6/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
