[发明专利]基因疗法DNA载体VTvaf17、生成方法；大肠杆菌菌株SCS110-AF、生成方法；携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17、生成方法

说明书

本发明涉及遗传工程，并且可用于生物技术、医学和农业。本发明需要构建3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17，用于含有核苷酸序列SEQ ID No.1的动物和人细胞的遗传修饰。构建3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17的方法包括首先构建4182bp载体，然后通过SpeI限制性位点将它切割，并且将剩余的片段与其自身连接，该4182bp载体含有具有内在增强子的人延伸因子EF1A的1188bp启动子区、具有限制性内切核酸酶BamHI、EcoRV、Sail、HindIII、KpnI、EcoRI的位点的35bp多接头、466bp转录终止子和人生长因子的多腺苷酸化序列、允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的136bp调节元件RNA‑OUT、具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中的载体生成的用于自主复制的1299bp复制起点、1010bp卡那霉素抗性基因。可以通过获得大肠杆菌菌株SCS110‑AF以生成基因疗法DNA载体VTvaf17或允许无抗生素阳性选择的基于其的基因疗法DNA载体实现规定的目的。获得大肠杆菌菌株SCS110‑AF以生成基因疗法DNA载体VTvaf17或基于其的基因疗法DNA载体的方法包括构建64bp的线性DNA片段，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并挑选出在含10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆，该线性DNA片段含有允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的调节元件RNA‑IN、1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB(其产物确保在含蔗糖的培养基中进行选择)、挑出发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR、确保与基因失活同时的基因recA区域中的同源重组的两个同源序列329bp和233bp。还构建了携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，以编号B‑12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)，用于允许无抗生素的选择的其进一步开发。获得携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110‑AFA/Tvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，以编号B‑12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)的方法包括制备大肠杆菌菌株SCS110‑AF的电感受态细胞，并且用基因疗法DNA载体VTvaf17对这些细胞进行电穿孔。之后，将细胞倒入具有含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素。

发明领域

本发明涉及遗传工程，并且可以用于生物技术、医学和农业中以制造基因疗法产品。即，可以将生成的含有靶基因的基因疗法DNA载体递送到经历该基因表达减少或不足的人和动物的细胞，从而确保期望的治疗效果。

发明背景

基因疗法是一种医学创新方法，目的是通过将新的遗传材料递送到患者细胞中来补偿或抑制突变体基因的功能和/或治疗遗传病症来治疗遗传性和获得性疾病。

遗传材料(基因疗法载体)的转运蛋白分为病毒和非病毒载体。最有效的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、痘病毒和腺病毒(Lukashev AN,Zamyatnin AA Jr.Viral Vectors for Gene Therapy:Current State and ClinicalPerspectives.Biochemistry(Mosc).2016.81:700-708.)。遗传材料的非病毒递送主要涉及携带治疗基因并与各种载体(如脂质、阳离子聚合物、树状聚合物、多肽和纳米颗粒)结合的质粒(Mintzer MA,Simanek EE.Nonviral vectors for gene delivery.ChemRev.2009.109:259-302)。

尽管就速度和效率而言，病毒天然几乎是将重组DNA递送到细胞中的理想试剂，但病毒递送系统的使用仍存在一些实际限制。这些包括制造挑战、缺乏选择性、免疫应答、潜在的致癌风险以及转导后的炎症。这些中的一些问题尚未解决。这就是为何最近的基因疗法越来越重视非病毒基因递送系统的开发。