[发明专利]III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途

说明书

本发明涉及III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途，特别是，涉及来自藻(优选真核褐藻)的III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途。本发明还涉及显示出间苯三酚合酶活性的多肽以及编码上述III型聚酮合酶的分离的核酸分子，以及包含这种核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及生产间苯三酚的方法。

技术领域

本发明属于微生物生物化学的领域，更具体而言，属于通过微生物酶合成间苯三酚的领域。本发明涉及III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途，特别是藻的(优选真核褐藻(ochrophytes))的III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途。

背景技术

间苯三酚是一种芳香族有机化合物，特别用于医药产品和爆炸物的生产中。

间苯三酚合成被称为间苯三酚合酶的III型聚酮合酶催化。根据以下反应流程，间苯三酚合酶进行三个丙二酰基-CoA分子的缩合反应，从而形成间苯三酚分子(反应I)：

随后可以从间苯三酚合成许多低聚物，例如褐藻多酚。褐藻多酚具体包括多羟基联苯(fucols)、根皮素和岩藻糖根皮素，它们是由间苯三酚衍生的产物，其构成褐藻的壁。另外，褐藻的各种保护活性也归因于褐藻多酚。

目前，仅在革兰氏阴性荧光假单胞菌细菌(Achkar等人,2005；Zha等人,2006)和褐藻外子藻(Ectocarpus siliculosus)(Meslet-Cladière等人,2013)中描述了间苯三酚的合成。在这两个物种中已鉴定出参与间苯三酚合成的间苯三酚合酶。它们是迄今为止鉴定和表征的仅有的两种间苯三酚合酶。

在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中，间苯三酚合酶由PHLD基因编码(Achkar等人,2005；Zha等人,2006)。

在外子藻中，间苯三酚合酶由PKS1基因编码(Meslet-Cladière等人，2013)。

有可能在表达异源PHLD基因的大肠杆菌(Escherichia coli)中证明PHLD间苯三酚合酶的活性(Achkar等人,2005)。通过用从重组大肠杆菌培养物中表达和纯化的异源PHLD进行的小规模酶学测试，已在体外证实了这种活性(Zha等人，2006)。

已经在体外通过大肠杆菌中表达和纯化的重组PKS1以及外子藻(E.siliculosus)的细胞提取物证明了PKS1间苯三酚合酶的活性(Meslet-Cladière等人,2013,WO 2013/045510)。

但是，PHLD和PKS1酶表现出较低的酶活性。另外，尚未证明使用这些酶在体外大规模合成间苯三酚的可能性。最后，在这些研究中使用的间苯三酚合酶是由大肠杆菌或荧光假单胞菌细菌产生的。因此，当这些酶由真核生物例如酵母或昆虫或哺乳动物细胞产生时，其活性是未知的。然而，真核系统可能是有利的，特别是对于大规模生产。实际上，这使得可能获得更接近起源真核生物酶的酶，特别是因为所述酶能够在翻译后水平上的修饰。

因此，仍然需要鉴定在体外或体内具有高间苯三酚合成酶活性的新的间苯三酚合酶，其适于工业规模生产并且可以通过真核系统来生产。

然而，聚酮合酶的确切功能表征由于以下事实而变得复杂：该类酶将具有大的序列相似性的蛋白质汇集在一起，而他们可以催化基本不同的反应并识别完全不同的底物。

结果，在其他生物体中鉴定新型间苯三酚合酶的尝试并未成功。尤其是，已知马尾藻属(Sargassum sp.)的多种菌株能够产生间苯三酚。为了鉴定负责该产物合成的酶，在宾德马尾藻(S.binderi)中鉴定了推定的III型聚酮合酶。测试了这些候选酶的间苯三酚合酶活性。这些测试表明，在宾德马尾藻中鉴定出的这些III型聚酮合酶均未显示出这种活性(Baharum等人，2011)。