[发明专利]RNA模板化连接

权利要求书

1.一种检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：

a)使所述样品与锁式探针接触并且使所述探针与所述靶核酸分子杂交；

b)使用DNA/RNA连接酶使所述样品进行连接反应，以连接并从而环化已与所述靶核酸分子杂交的任何探针；

c)通过用DNA聚合酶进行滚环扩增以扩增来自步骤(b)的连接的环化探针；以及

d)检测来自步骤(c)的扩增产物，从而检测所述靶核酸序列；

其中所述锁式探针以一个或多个部分提供，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，使得任选地在切割所述杂交探针和/或使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建连接位点；并且

其中任选地在所述切割和/或延伸步骤之后，所述探针在连接位点处或附近包含至少一个核糖核苷酸，并且所述连接的环化探针主要由DNA构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸序列是靶RNA序列，并且其中所述靶核酸分子是靶RNA分子。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述探针包含两个或更多个部分，其中创建至少两个连接位点。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述探针在连接位点处的可连接3'末端处或附近包含所述至少一个核糖核苷酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述可连接3'末端通过延伸与所述靶核酸分子杂交的所述探针或其部分的3'末端来创建。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述探针在所述探针或其部分的3'末端处或附近包含所述至少一个核糖核苷酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述探针或其部分的3'末端和/或3'倒数第二个核苷酸是核糖核苷酸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述探针在连接位点处的5'可连接末端处不含核糖核苷酸。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述探针或其部分的5'可连接末端通过在所述探针与所述靶分子杂交时切割所述探针来创建。

10.根据权利要求9所述的方法，其中第一靶标特异性靶结合位点位于所述探针或探针部分的5'末端内部并且第二靶标特异性结合位点位于所述探针或探针部分的3'末端处，使得在所述探针或探针部分与所述靶核酸分子杂交后，所述探针或探针部分包含所述第一靶标特异性结合位点的附加序列5'，所述附加序列5'不与所述靶核酸分子杂交并且形成5'活瓣，所述5'活瓣通过切割移除，从而创建5'可连接末端。

11.根据权利要求10所述的方法，其中形成所述5'活瓣的所述附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸与所述靶核酸分子中的同源核苷酸互补，其中所述核苷酸不能和所述探针或探针部分的3'可连接末端同时与所述靶核酸分子杂交。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述附加序列包含一个或多个核糖核苷酸。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸是核糖核苷酸。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述附加序列的最3'核苷酸是核糖核苷酸。