[发明专利]核酸扩增中的可逆热力学陷阱(热陷阱)

权利要求书

1.一种用于扩增核酸序列的方法，包括：

a.准备反应混合物，该反应混合物包含：

i.核酸样品；

ii.第一核酸扩增引物，其具有与所述样品的第一靶区域互补的3’区域以及不与所述样品的区域互补且具有自然界中不存在的序列的5’区域；其中，所述5’区域或者为自身互补，从而使得所述第一核酸扩增引物的第一链的5’端能够杂交至所述第一核酸扩增引物的第二链的5’端，或者所述第一核酸扩增引物的所述5’区域与第二核酸扩增引物的5’区域互补，并且其中所述第一核酸扩增引物的5’非互补区域通过不能被聚合酶复制的间隔单元连接至所述引物；

iii.核酸聚合酶；

iv.核苷三磷酸单体；以及可任选的

v.第二核酸扩增引物，其具有与第一引物的延伸产物互补的3’区域以及与所述第一引物的5’区域互补且不与所述样品的区域互补的5’区域；

b.使所述第一引物杂交至所述样品；

c.使用所述核酸聚合酶和核苷三磷酸单体使所述第一引物延伸；以及

d.重复步骤b和c，由此扩增靶序列，其中所述第一核酸扩增引物杂交至所述样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中仅通过第一扩增引物进行所述扩增。

3.根据权利要求1所述的方法，其中通过第二扩增引物进行所述扩增。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述扩增是恒温的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中通过使用酶从所述样品中置换经延伸的引物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶为解旋酶或重组酶。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述扩增是热循环的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸扩增引物的所述5’非互补区域的熔解温度低于所述第一核酸扩增引物的3’靶互补区域的熔解温度。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸扩增引物的所述5’非互补区域为回文结构。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸扩增引物和所述第二核酸扩增引物的所述5’非互补区域相同且为回文结构。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述间隔单元为烷基(CH₂)链或乙二醇(CH₂O)链。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述间隔单元为改性的核苷酸或核糖核苷酸。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法使用多于一种第一核酸扩增引物。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法使用多于一种第二核酸扩增引物。

15.一种用于核酸序列扩增的试剂盒，包含：

a.第一核酸扩增引物，其具有与样品的第一靶区域互补的3’区域以及不与所述样品的区域互补且具有自然界中不存在的序列的5’区域；其中，所述5’区域或者为自身互补，从而使得所述第一核酸扩增引物的第一链的5’端能够杂交至所述第一核酸扩增引物的第二链的5’端，或者所述第一核酸扩增引物的所述5’区域与第二核酸扩增引物的5’区域互补，并且其中所述第一核酸扩增引物的5’非互补区域通过不能被聚合酶复制的间隔单元连接至所述引物；

b.核酸聚合酶；

c.核苷三磷酸单体；以及可任选的

d.第二核酸扩增引物，其具有与第一引物的延伸产物互补的3’区域以及与所述第一引物的5’区域互补并具有自然界中不存在的序列、并且不与所述样品的区域互补的5’区域。