[发明专利]抑制HIV-1逆转录酶的组合物和方法

说明书

本说明书提供采用焦磷酸盐类似物的组合物和方法，其中桥氧被替换为亚氨基(PNP)以提高逆向聚合酶反应的速率。

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2017年8月8日提交的美国临时专利申请No.62/542,600的优先权和权益。该申请的全部教导通过引用并入此处。

政府资助

支持该申请的研究由美国进行，由美国卫生和公共服务部部长代表。

技术领域

本说明书提供了抑制由HIV-1逆转录酶(RT)进行的核酸扩增的组合物和方法。

背景技术

DNA聚合酶在基因组复制和修复过程中合成DNA。因此，它们是用于不受控制的细胞生长(例如，癌症和病毒感染)的化学疗法中有吸引力的靶标。至少有17种人类DNA聚合酶，它们利用常见的核苷酸转移酶反应，其中脱氧核苷三磷酸(dNTP)以模板依赖性方式添加到生长中的DNA引物3'末端。该反应需要至少两个二价金属离子，以促进引物3'-氧阴离子内联亲核攻击引入的dNTP的Pα，导致引物链延伸一个核苷酸(即dNMP)和焦磷酸盐(pyrophosphate,PPi)。该反应是可逆的，因此在称为焦磷酸解的过程中，PPi和DNA可以生成dNTP和短一个核苷酸的DNA引物链。

尽管有意地偏好进行正向DNA合成反应，但焦磷酸解在生物学上可能很重要。链终止性核苷药物经常用于试图阻止DNA合成。但是，对链终止剂的抗药性可能与停滞的DNA聚合酶通过焦磷酸解去除这些核苷酸的能力有关。另外，焦磷酸解可以去除与某些DNA损伤相对的错误插入的核苷酸，作为一种校正活性，从而提高了损伤旁路的保真度。

DNA聚合酶β(polβ)是一种用于计算机、结构、动力学和生物学研究的模型DNA聚合酶。Polβ的焦磷酸解活性高度依赖于DNA底物的性质。为了在焦磷酸解中产生有效的底物结合，引物3'末端必须结合在核苷酸结合袋中。相反，DNA合成则要求引物的末端不要封闭该位点，而位于其边界。这些位点称为N位点(核苷酸；即插入之后和易位之前)和P(引物)位点。结构研究表明，引物末端优先在P位点结合一个核苷酸缺口(gapped)的DNA，而优先在N位点结合切口(nicked)DNA。在带有带切口的DNA的polβ二元复合物晶体中添加PPi–Mg2+，会生成稳定的三元产物复合物(pol–DNA切口–PPi)。由于逆向反应不利的平衡，pol-DNA缺口-dNTP复合物的水平将超出结构检测的限度。

在这里，我们已经对焦磷酸解进行了动力学表征，并鉴定了一种PPi类似物亚氨二磷酸盐(imidodiphosphate，PNP)，它可以改变内部平衡，从而允许通过延时X射线晶体学进行结构表征。尽管焦磷酸解受非化学步骤的限制，但用亚氨基取代PPi的桥氧会导致限速步骤发生变化，因此PNP依赖性逆向反应受化学作用的限制。这些结果影响了我们对DNA聚合酶核苷酸转移酶化学机理的理解，并且关键的酶结构转变会影响功能。

有人指出，焦磷酸解在DNA聚合酶保真度、和HIV-1逆转录酶以及线粒体DNA聚合酶γ对链终止核苷药物的敏感性中发挥作用。一直需要有效的疗法来治疗与不希望的DNA复制相关的疾病，例如癌症和病毒感染，例如HIV-1。因此，对逆向反应的更好理解，对于定义影响或调节这些所述活性的总体反应是必不可少的，并且是合理药物设计的前提。

发明内容

本说明书涉及焦磷酸解的动力学表征和PPi类似物亚氨二磷酸盐(PNP)的鉴定，PNP改变内部平衡，从而允许通过延时X射线晶体学进行结构表征。尽管焦磷酸解受非化学步骤的限制，但用亚氨基取代PPi的桥氧会导致限速步骤发生变化，因此PNP依赖性逆向反应受化学作用的限制。这些结果影响了我们对DNA聚合酶核苷酸转移酶化学机理的理解，并且关键的酶结构转变会影响功能。