[发明专利]PCV2b ORF2蛋白在昆虫细胞中的重组表达

说明书

本发明涉及兽医疫苗的领域，尤其涉及针对PCV2和相关疾病的猪疫苗。具体地，本发明涉及以下发现：在PCV2b ORF2蛋白中需要突变，以防止其在昆虫细胞中表达后的核积累；所述突变在氨基酸位置131处引入脯氨酸。这允许在昆虫细胞中的有效表达，容易收获，且生成大量病毒样颗粒。VLP在猪的疫苗中对于减少PCV2的感染或相关疾病体征高度有效。

本发明涉及兽医疫苗的领域，尤其涉及针对PCV2的猪疫苗。具体地，本发明涉及包含表达突变型PCV2b ORF2蛋白的异源核酸序列的昆虫细胞，突变型PCV2b ORF2蛋白的病毒样颗粒，昆虫细胞或突变型PCV2b ORF2蛋白的生产或使用方法，以及猪动物的疫苗。

猪圆环病毒2(PCV2)是猪动物的病原体，其在全世界存在，并引起许多动物患病并给农业部门造成严重的经济损失。对于综述，参见Gillespie等人 (2009, J. Vet.Intern. Med., vol. 23, p. 1151-1163)。

PCV2属于圆环病毒科(Circoviridae)，而且具有小的(17 nm)二十面体无包膜病毒粒子，其含有约1.76 kb的环状、单链DNA基因组。该基因组仅含有几个开放阅读框，其中ORF2编码含有主要的病毒中和表位的病毒衣壳蛋白。

PCV2是相对稳定且高度感染性的。其经由不同种类的机体-分泌而脱落，并且可以在猪群中横向和纵向传播。由PCV2感染引起的主要病变是淋巴耗竭；所得的免疫抑制还使受感染动物对继发性或并发性感染易感。因此，PCV2参与许多猪疾病综合征，其统称为：猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。最显著的PCVAD是在幼龄猪中观察到的“断奶后多系统衰竭综合征”(PMWS)。PMWS的临床体征和病理包括渐进性消瘦、呼吸困难、呼吸急促、以及偶尔的黄疸(icterus)和黄疸病(jaundice)。其他PCVAD是：猪呼吸道疾病综合症、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、先天性震颤、和渗出性表皮炎。对于综述，参见：the MerckVeterinary Manual, 第11版, 2016, ISBN: 9780911910933；和：“Diseases of Swine”,第10版, 2012, ISBN: 9780813822679。

然而，在没有继发性感染的情况下，大多数PCV2感染的猪可能不显示清晰的疾病临床症状，除了明显健康的猪中的不良生长和表现。由PCV2引起的PCVAD的(亚-)临床症状通常可从3或4周龄起(这是小猪断奶并且保护性的母体来源的抗体开始下降的时间)在猪中观察到。

为了针对PCV2感染及其相关疾病体征进行保护，几种商业疫苗可得，并且这些正在全世界以非常大量使用。不同类型的PCV2疫苗是例如：基于灭活的完整PCV2病毒的疫苗(Circovac™, Merial)或基于灭活的嵌合PCV1/PCV2病毒的疫苗(Suvaxyn™ PCV,Fostera™ PCV, Zoetis)。然而，最常见的是基于重组表达的PCV2衣壳蛋白、通常命名为：ORF2蛋白的亚单位疫苗(Ingelvac™ CircoFLEX, Boehringer Ingelheim；和：Circumvent™ PCV, Porcilis™ PCV, MSD AH)。ORF2蛋白亚单位疫苗通常通过在重组表达系统中表达PCV2 ORF2基因来产生；最常用的是杆状病毒-昆虫细胞表达系统。表达的ORF2蛋白自组装成病毒样颗粒(VLP)，其类似于天然PCV2病毒粒子，除了其缺乏病毒基因组内容物，且因此是非复制性的。基于此类PCV2 ORF2 VLP的疫苗非常稳定，当与佐剂一起配制时是高度免疫原性的，并且已表明对所有年龄的猪都是安全的，无论是否对于PCV2抗体呈血清阳性。典型全剂量的基于PCV2 ORF2蛋白的疫苗含有约80 µg ORF2蛋白，剂量体积为2 ml/动物。然而，这些亚单位疫苗在每动物剂量约20微克ORF2已经有效，参见EP 1.926.496。它们也可以作为单次注射疫苗给予，并且它们可以通过不同的施用途径(诸如肌肉内(IM)、皮下(SC)或皮内(ID))给予。