[发明专利]细胞内递送及其方法

说明书

本发明公开用于转染细胞以将外源性材料引入细胞的方法和装置。所述方法包括在电场存在的情况下将细胞暴露在非恒定流区域，在不使细胞裂解的情况下促进将外源性材料引入细胞中。

技术领域

本发明涉及一种用于将外源性材料引入受非恒定流(unsteady flow)影响的细胞中的方法，包括在外源性材料存在下将细胞暴露于电场。

背景技术

生物微流体可用于分离或富集(Shields et al.2015)，修饰，培养和鉴定细胞。因此，生物微流体适用于基因修饰细胞疗法(GMCT)的开发和制造，其中细胞需要被分离或富集，修饰，培养和鉴定。基于修饰的T细胞的GMCTs可以为患有某些血液系统恶性肿瘤的患者提供明显改善的预后。具体地，以CD19为靶点的嵌合抗原-受体-T细胞免疫疗法(CAR-T)已显示出显著的反应，并可能治愈对所有先前疗法均无反应的晚期急性淋巴细胞白血病患者。基因修饰的CAR-T细胞是第一个获得FDA(FoodDrug Administration)批准用于治疗癌症的细胞疗法，在此之前，急性淋巴细胞白血病的缓解率为83％。

CAR-T细胞是通过对人T细胞进行基因修饰产生的，其导致修饰后的人T细胞在一个或多个共刺激域以及细胞内CD3-zeta激活域上显示出针对与铰链区连接的肿瘤靶标的细胞外单链可变片段。这些治疗方法的生产成本高、耗时长、通量相对较低，并且根据所修饰的细胞类型可能会产生不同的结果。此外，GMCT制造过程中最成问题的步骤是通过转染或转导细胞内递送核酸以在T细胞表面上表达CAR。病毒转导(如逆转录病毒和慢病毒)是目前用于CAR-T治疗临床试验的主要方法。然而，这些方法在生产过程中需要大量时间，并且需要广泛的生产中和生产后安全性测试，以避免在治疗期间注射具有复制能力的病毒。

物理转染方法，例如电穿孔，是GMCT制造的理想选择。电穿孔不需要广泛的安全性或释放预防措施，可用于向细胞内递送更广泛的外源性材料(例如DNA，RNA，蛋白质和/或各种复合物)，但会导致细胞的显著损失或正常细胞功能的改变。许多替代的物理递送方法正在开发中，以解决这些问题。通常，由于更加一致的处理条件(细胞直径和微流体通道几何形状处于相同的数量级)，微流体方法比宏观尺度方法有了改进。微流体在细胞内物理递送方法的示例包括流过电穿孔，微针注射，细胞挤压，流体剪切以及声波喷射。尽管这些方法为当前GMCT生产提供了有前途和有吸引力的替代方案，但它们受到通量，处理速度，堵塞和/或从研究平台到临床生产的繁琐转换的限制。还应注意的是，传统的机械操作系统和方法在机械操作后通常需要层流或静态流动条件。

用于产生GMCTs(如CAR-T疗法)的理想细胞内递送平台应该在不同的外源材料(例如DNA，RNA，蛋白质和/或各种复合物)之间是灵活的，并且适用于各种细胞类型，且对细胞存活率、回收率和正常细胞活动的干扰最小。目前，正在用一系列外源性材料修饰T细胞以产生GMCTs，包括质粒，RNA和Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)。RNA特别令人感兴趣，因为它在细胞内递送至T细胞后具有一系列修饰方式的显着效用。这包括以永久，长期和短暂的方式编辑各种T细胞基因组外源材料，以表达嵌合抗原受体(CAR)。