[发明专利]食道组织和/或类器官组合物及其制备方法

权利要求书

1.一种制备食道类器官(EO)的方法，其包括：

a.使定形内胚层与BMP抑制剂、Wnt激活剂、FGF激活剂和视黄酸(RA)接触第一时间段以形成前段前肠培养物，其中所述前段前肠培养物表达SOX2和HNF1B，其中所述前段前肠培养物基本上不表达PROX1和HNF6；

b.使所述前段前肠培养物与BMP抑制剂(Noggin)和EGF激活剂接触足以形成背侧前段前肠(“dAFG”)球体的第二时间段，其中所述dAFG表达SOX2和TP63但不表达PDX1、PAX9或NKX2.1；

c.培养所述dAFG足以允许形成食道类器官(EO)的第三时间段，其中所述培养在EGF存在下进行，进一步任选地包括FGF信号传导通路激活剂，优选FGF10。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述BMP信号传导通路抑制剂选自Noggin、Dorsomorphin、LDN189DMH-1及其组合，优选地其中所述BMP信号传导通路抑制剂为Noggin。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述BMP抑制剂以约50至约1500ng/ml的浓度存在。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WNT激活剂选自一种或多种分子，所述分子选自：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、GSKβ抑制剂(例如CHIR99021、即“CHIRON”)、BIO、LY2090314、SB-216763、锂、豪猪抑制剂IWP、LGK974、C59、SFRP抑制剂WAY-316606、β-catenin激活剂DCA。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路激活剂的浓度为约50至约1500ng/ml的浓度。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FGF激活剂选自一种或多种分子，所述分子选自：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23，及其组合，优选FGF4或FGF10，或其组合。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FGF通路激活剂的浓度为约50至约1500ng/ml的浓度。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一时间段是约三天±24小时。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二时间段是三天±24小时

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三时间段是约28天±48小时，或约21天至约90天，或约30天至约60天。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层衍生自前体细胞，所述前体细胞选自胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞、中胚层细胞、定形内胚层细胞、后内胚层细胞、后内胚层细胞和后肠细胞，优选衍生自多能干细胞的定形内胚层，更优选衍生自选自胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞的多能干细胞的定形内胚层。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层是通过使多能干细胞与选自活化素、生长因子的TGF-β超家族的BMP亚组；Nodal、Activin A、Activin B、BMP4、Wnt3a及其组合的一种或多种分子接触而衍生。根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DE是DE单层，其中所述DE单层中大于90％的细胞共表达FOXA2和SOX17。