[发明专利]细胞的培养方法

说明书

作为使神经嵴细胞增殖而不降低分化能力的技术，本申请提供了神经嵴细胞的制造方法，其包括(1)获得神经嵴细胞的工序，和(2)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，该培养基包含显示与超过1μM、低于5μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。

技术领域

本发明涉及神经嵴细胞的制造方法及增殖方法，培养基，冷冻保存物，以及自神经嵴细胞制造各种细胞的方法。详言之，本发明涉及神经嵴细胞的制造方法及增殖方法以及在所述方法中使用的培养基，包含神经嵴细胞的冷冻保存物，以及可自神经嵴细胞分化诱导得到的各种细胞的制造方法。

发明背景

神经嵴细胞(Neural Crest Cell:NCC)，是指在发育早期自神经板形成神经管时，在神经外胚层和表皮外胚层之间发生的细胞，其具有分化为神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞等多种细胞的多能性(multipotency)以及自我增殖能力。这样的多能性(multipotency)及自我增殖能力显示出神经嵴细胞作为再生医疗中的细胞药物的有用性，对高效地维持或增殖神经嵴细胞的技术存在需求。

非专利文献1中，记载了自人诱导性多能性细胞(iPSC)诱导神经嵴细胞，进一步自神经嵴细胞诱导间充质基质细胞等。非专利文献1中，神经嵴细胞的维持培养使用添加TGFβ抑制剂、表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，也称为“FGF2”)的培养基，采用粘附培养来进行。

另外，非专利文献2中，记载了由鸡胚神经管诱导神经嵴细胞，且进一步自神经嵴细胞诱导胶质细胞等。在非专利文献2中，神经嵴细胞的维持培养使用添加鸡胚提取物、胰岛素样生长因子(IGF)、bFGF及视黄酸(RA)的培养基，通过悬浮培养来进行。

非专利文献3中，记载了自人胚胎干细胞(ESC)或人iPSC诱导神经嵴细胞，进一步自神经嵴细胞诱导平滑肌细胞等。非专利文献3中，神经嵴细胞的维持培养使用添加GSK3β抑制剂及TGFβ抑制剂的培养基，通过粘附培养来进行。

进一步地，非专利文献4中，记载了自人iPSC诱导神经嵴细胞，并通过使用添加GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、EGF及bFGF的培养基通过粘附培养或悬浮培养而维持。非专利文献4报道了通过粘附培养进行维持培养时，培养细胞团中的神经嵴细胞的数及比例，其在bFGF的浓度为0pg/ml-10ng/ml的范围中浓度依赖性地减少(参照图5A～C)。另外，通过悬浮培养进行维持培养时，使用1μM的CHIR99021作为GSK3β抑制剂培养7天，确认Sox10阳性细胞的存在，但不清楚该细胞是否具有多能性(multipotency)。

需要注意，非专利文献1～4中的任一篇都没有记载通过使用添加超过1μM的浓度的CHIR99021和bFGF的培养基而悬浮培养神经嵴细胞并由此使其维持并增殖。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1Fukuta M等人，＂Derivation of mesenchymal stromal cells frompluripotent stem cells through a neural crest lineage using small moleculecompounds with defined media.＂，PLoS One，2014，9(12):e112291.

非专利文献2Kerosuo L等人，＂Crestospheres:Long-Term Maintenance ofMultipotent，Premigratory Neural Crest Stem Cells.＂，Stem Cell Reports，2015，5(4):499-507.