[发明专利]使用寡核苷酸的多样性文库合成多核苷酸的新方法

权利要求书

1.用于合成具有预定序列的靶双链(ds)多核苷酸的方法，包括：

a)在阵列装置内提供寡核苷酸文库，所述寡核苷酸文库包含多样性寡核苷酸文库成员，其中每个文库成员具有不同的核苷酸序列，并且包含在水溶液中的单独的文库容器中，该多样性包括具有至少一个突出端且覆盖至少10,000对匹配的寡核苷酸的单链寡核苷酸(ss寡核苷酸)和双链寡核苷酸(ds寡核苷酸)，

b)在第一步骤中，使用液体处理器将至少第一对匹配的寡核苷酸从所述文库转移至第一反应容器中，并组装所述匹配的寡核苷酸，从而获得包含至少一个突出端的第一反应产物，

c)在第二和其他步骤中，使用液体处理器将至少第二和其他对的匹配的寡核苷酸从所述文库分别转移到第二和其他的反应容器中，并组装所述匹配的寡核苷酸，从而分别获得各自包含至少一个突出端的第二和其他的反应产物，

d)以预先确定的工作流程组装所述第一、第二和其他反应产物，从而产生具有突出端的所述靶ds多核苷酸，任选地随后进行最终步骤以制备平末端，

其中使用算法确定步骤b)和c)中使用的所述匹配的寡核苷酸对和组装工作流程，以产生所述靶ds多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中使用相同的寡核苷酸文库合成一系列不同的靶ds多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述不同的靶ds多核苷酸具有小于50％，优选小于30％的序列同一性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述ss寡核苷酸的长度为6至26nt。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述ds寡核苷酸的长度为6至26bp，并且所述突出端不超过各自ds寡核苷酸长度的一半。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多样性涵盖经过磷酸化、甲基化、生物素化或与荧光团或猝灭剂连接中的任一种或多种修饰的ss寡核苷酸和/或ds寡核苷酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述靶ds多核苷酸的长度为至少48bps。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述组装是通过连接反应进行的，所述连接反应是酶促和/或化学反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述连接反应是使用连接酶或聚合酶或核酶的酶促连接反应，所述连接酶优选T3、T4或T7 DNA连接酶。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述组装是直接通过杂交匹配的突出端或间接地通过杂交适宜的ss寡核苷酸接头进行的，所述ss寡核苷酸接头是包含在所述文库中的ss寡核苷酸，该ss寡核苷酸从所述文库中选择并转移以组装所述第一、第二或其他反应产物中的任意。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述靶ds多核苷酸的核苷酸序列与模板相同。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中通过定向诱变、核酸内切酶或核酸外切酶中的任意进一步修饰所述靶ds多核苷酸，以获得具有目标序列(SOI)的所述多核苷酸。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中进一步修饰所述靶ds多核苷酸以产生其衍生物，所述衍生物为ds DNA、ss DNA或RNA分子中的任一种，优选地，其中修饰方法为任意一种酶促修饰，使用甲基转移酶、激酶、CRISPR/Cas9、多重自动基因组工程(MAGE)、接合组装基因组工程(CAGE)、Argonaute蛋白(Ago)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、杂交分子、硫酸化酶、重组酶、核酸酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶或TNase中的任意。