[发明专利]通过单向双重探针引物延伸的靶标富集

说明书

本发明提供了用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法。第一寡核苷酸与具有第一和第二衔接子的核酸文库中的靶标核酸杂交。用第一聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸，由此产生包括所述靶标核酸和延伸的第一寡核苷酸的第一引物延伸复合物。捕获所述第一引物延伸复合物，其相对于所述核酸文库富集，且第二寡核苷酸与所述靶标核酸杂交。用第二聚合酶延伸杂交的第二寡核苷酸，由此产生包括所述靶标核酸和延伸的第二寡核苷酸的第二引物延伸复合物，且进一步从所述第一引物延伸复合物释放延伸的第一寡核苷酸。

发明领域

本发明通常涉及富集样品中的核酸靶标，并且更具体地涉及富集用于核酸测序(包括高通量测序)的靶标。

背景

本发明属于一类允许使用者聚焦于待测序核酸内的目标区域的技术。这降低了与测序反应和随后的数据分析相关的成本。目前有三种一般类型的选择性捕获样品中存在的核酸内的目标区域的技术。第一种技术是杂交捕获，其中通过可以选择性结合至捕获表面的探针的杂交来捕获目标区域。该捕获允许除去非靶标核酸，随后释放和收集捕获的靶标分子。这种类型的技术具有优点，包括捕获外显子组大小的区域和包含未知结构变异的区域的能力。缺点包括长而复杂的方案，其倾向于花费超过8小时来完成。复杂性主要由在杂交前制备随机片段化的鸟枪文库的需求所引起。单独的杂交步骤可能需要三天来完成。这种类型的技术的实例包括SECAP EZ靶标富集系统(ROCHE)和SURESELECT靶标富集系统(AGILENT)。

靶标富集的另一种方法是基于双重靶标引物的扩增。在该方法中，在靶标的边界上使用两个探针来富集目标区域。所述方法倾向于花费少于8小时来完成，并且比杂交捕获方法更简单。然而，基于双重引物的技术不能富集具有未知结构变异的序列。最成熟的双重引物方法是多重聚合酶链式反应(PCR)。这是一个非常简单的单一过程，但在每个反应管只能扩增数十种靶标。目前可用其他更新的技术，包括TRUSEQ扩增子测序试剂盒(ILLUMINA)和ION TORRENT AMPLISEQ测序试剂盒(LIFE TECHNOLOGIES)产品，其能够在单个反应管中扩增数百至数千种靶标，并且仅需要几个处理步骤。

第三种技术是基于单靶标引物的扩增。在该方法中，通过扩增由单个靶标引物和末端连接的通用引物限定的区域来富集靶标。类似于基于杂交的方法；这些技术需要在靶标寡核苷酸的选择性杂交之前产生随机片段化的鸟枪文库。然而，不是使用该寡核苷酸来捕获靶标并洗掉非靶标分子，而是采用扩增步骤，其选择性扩增随机产生的末端和靶标特异性寡核苷酸之间的区域。该技术的优点在于，不同于双重引物技术，其允许检测具有未知结构变异的序列。它比基于杂交的技术更快且更简单。然而，这种类型的技术仍比基于双重引物的方法更慢且更复杂。这种类型的技术的实例是ARCHER的锚定多重PCR (ARCHER DX)和OVATION靶标富集系统(NUGEN)。

对于也将容纳靶标序列中未知的结构变异的快速和简单的靶标富集的方法，仍然存在未满足的需求。

概述

根据一个实施方案，本发明提供了用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法。所述方法包括将第一寡核苷酸与核酸文库中的靶标核酸杂交。所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端。所述方法进一步包括用第一聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸，由此产生包含所述靶标核酸和延伸的第一寡核苷酸的第一引物延伸复合物。所述方法进一步包括捕获所述第一引物延伸复合物，相对于所述核酸文库富集所述第一引物延伸复合物，将第二寡核苷酸与所述靶标核酸杂交，和用第二聚合酶延伸杂交的第二寡核苷酸，由此产生包含所述靶标核酸和延伸的第二寡核苷酸的第二引物延伸复合物，由此从所述第一引物延伸复合物释放延伸的第一寡核苷酸。所述方法进一步包括用第三聚合酶、第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述靶标核酸，所述第一扩增引物具有与第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。

在一个方面，所述方法进一步包括对扩增的靶标核酸进行测序。

在另一个方面，所述第一寡核苷酸包含捕获部分。