[发明专利]重组多肽中的工程化O-糖基化及其用途

说明书

本发明涉及具有工程化的O‑连接的氨基酸(AA)糖基化序列(基序)的重组多肽治疗剂，该O‑连接的氨基酸(AA)糖基化序列(基序)与一个或多个O‑聚糖(标签)共价连接。可在哺乳动物细胞中产生重组O‑糖基化多肽，以通过代谢标记呈现天然或非天然的O‑聚糖结构。

以电子方式提交的材料通过援引并入

计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表通过援引以其全文并入本文，该序列表随此同时提交并确定如下：于2017年12月21日创建的、命名为“OGLYC-100-US-PSP-SequenceListing.TXT”的一份11，891字节的ASCII(文本)文件。

技术领域

本发明涉及具有工程化的O-连接的氨基酸(AA)糖基化序列(基序)的重组多肽治疗剂，该O-连接的氨基酸(AA)糖基化序列(基序)与一个或多个O-聚糖(标签)共价连接。可在哺乳动物细胞中产生重组O-糖基化多肽，以通过代谢标记呈现天然或非天然的O-聚糖结构。通过这种方法产生的多肽可受益于工程化O-聚糖结构，这些工程化O-聚糖结构提供了另外的功能性；最显著的是，可以通过化学缀合向工程化O-聚糖添加功能性部分。

背景技术

蛋白糖基化是常见且高度多样化的翻译后修饰(PTM)。在真核细胞中，这样的修饰可以分为两大类：N-连接的糖基化和O-连接的糖基化。典型地在细胞外；在N-连接的糖基化中，寡糖共价附接至天冬酰胺，而在O-连接的糖基化中，该附接通常发生在丝氨酸或酪氨酸的羟基上。

由糖基化反应产生的结构存在很大的多样性，对于在分泌型糖蛋白和细胞表面相关糖蛋白上发现的O-连接的粘蛋白型聚糖而言，这种差异是由留在分泌途径(特别是高尔基体)中的特异性转移酶的活性而引起的。它们通过连续的单糖缩合到/超过前体N-乙酰半乳糖胺(O-GalNAc，Tn抗原)来催化O-聚糖的成熟，前体N-乙酰半乳糖胺本身是通过多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶(ppGalNAc-T)同工酶的作用放置的。在聚糖结构本身的水平以及O-聚糖与蛋白骨架的附接位置方面存在多样性，这些是由O-糖基化序列基序和寡糖转移酶表达的独特相互作用以及养分的利用率和细胞活性精巧控制的。目前仅对该过程的细节有模糊的了解。

在自然界中，O-聚糖赋予许多期望的效果，这些效果是由诸如水合/电荷、蛋白-蛋白相互作用、骨架暴露/可及性和表面表位/识别等特性所提供的。例如，多肽中O-聚糖的存在可以赋予诸如屏障/润滑(一同地)、延长的半衰期(蛋白酶/降解抗性)、活性减弱(蛋白运输、受体信号传导)和蛋白折叠/聚集状态等特征。非天然O-聚糖可以提供进一步的期望性质。例如，多肽中O-聚糖的存在可以赋予改善的药物行为，诸如配制、延长半衰期或改变免疫原性。在进一步的进展中，还可以利用对多肽中非天然O-聚糖组成(或位置)的工程化。例如，接受后续化学反应，诸如点击化学缀合。在工程化治疗性多肽中可以利用许多这些特性。

可以向多肽中引入O-连接的糖基化以利用O-聚糖的一种或多种特性。然而，并非所有的多肽都具有O-连接的糖基化序列作为其氨基酸序列的一部分。另外，现有的O-连接的糖基化序列的O-糖基化可能无法有效地进行，和/或通过现有的O-连接的糖基化序列的糖基化而呈现的O-聚糖可能不是最适于利用的。因此，需要将O-糖基化位点工程化到多肽中。

US 9,187,532涉及将外源糖基化位点并入诸如BMP-7、NT-3和FGF-21等蛋白中。根据US 9,187,532的方法，在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达具有外源O-连接的糖基化序列的突变蛋白，并将其纯化。随后，通过将GalNAc体外添加到纯化蛋白中来尝试糖基化。