[发明专利]用于改善的免疫细胞疗法的NK抑制剂基因的靶向基因整合

权利要求书

1.用于制备用于细胞免疫疗法的工程化原代免疫细胞的方法，所述方法包括：

–提供包含T细胞的细胞群；

–向所述T细胞的一部分中引入：

i)至少一种核酸，其包含待整合在选定内源基因座上的外源多核苷酸序列，以编码至少一种NK细胞抑制剂；

ii)特异性靶向所述选定内源基因座的至少一种序列特异性试剂，

其中通过靶向基因整合将所述外源多核苷酸序列插入所述内源基因座。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述序列特异性试剂是核酸酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过同源重组或NHEJ至所述免疫细胞内操作所述靶向基因整合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将所述外源多核苷酸序列整合至在所述基因座处存在的内源启动子的转录控制下。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述内源基因座是表达MHC I组分如β2m的基因座。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述外源序列的所述插入使所述内源基因座处的β2m表达失活。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中选择所述内源启动子以在免疫细胞活化期间具有活性。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述内源基因座处的所述内源启动子对T细胞活化起反应，如选自表6的一种。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述T细胞被赋予有嵌合抗原受体(CAR)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中编码所述嵌合抗原受体(CAR)的外源序列已在TCR基因座处整合。

11.根据权利要求10所述的方法，其中编码所述嵌合抗原受体(CAR)的所述外源序列防止所述内源TCR序列的表达。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述内源基因座处的所述内源启动子的活性通过所述嵌合抗原受体(CAR)对所述T细胞活化起反应。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述特异性核酸内切酶试剂选自RNA或DNA引导的核酸内切酶，如Cas9或Cpf1、RNA或DNA向导、TAL核酸内切酶、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶或它们的任意组合。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述编码NK抑制剂的外源序列优选包含编码非多态性I类分子的序列，如HLA-G或HLA-E或其包含其重链表位的片段。

15.根据权利要求5至14中任一项所述的方法，其中当在β2m内源基因座处整合时，所述外源序列导致HLA-E或HLA-G或其片段与β2m片段的融合体的表达。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述HLA-E或HLA-G或其片段与β2m片段的融合体导致HLA-E或HLA-G的二聚体或三聚体的表达。

17.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述编码NK抑制剂的外源序列优选包含编码病毒逃避素或包含其表位的片段的序列，如来自UL16(也称为ULBP1-Uniprotref.:#Q9BZM6)的片段。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述T细胞是原代细胞，优选是人原代T细胞。

19.通过根据权利要求1至18中任一项所述的方法可获得的工程化T细胞。