[发明专利]应用径向技术色谱的系统和方法

说明书

本发明公开了一种使用多个珠粒的应用径向技术色谱的系统和方法，其中每个珠粒中包括一个或多个直径为约至约的孔，和每个珠粒的平均半径在约100pm至约250pm之间。还公开了选择用于径向流色谱柱中的珠粒的方法，以及使用径向流色谱柱纯化未澄清的进料流的方法。

技术领域

本发明涉及径向流柱色谱，更具体地，涉及一种包含特定尺寸和参数的珠粒以增强未澄清的进料流过滤的径向流柱，以及选择珠粒的方法。

背景技术

如通常所使用，色谱是一种用于分离样品混合物中各种组分的技术。在液相色谱系统中，将样品，随后是洗脱液注入色谱分离柱中。分离柱包含与待分离样品的各种组分相互作用的填料、基质介质或物质。分离介质的组成取决于被导入通过的液体以实现所需的分离。当样品和洗脱液通过分离介质时，由于不同的相互作用，样品的不同组分会以不同的速率通过分离介质。这些组分在出口或流出物处与分离介质出现分离。

各种类型的垂直流和水平流分离柱在本技术领域中是已知的。由于高效色谱的需要，水平流型色谱柱已得到发展。这种水平流或径向流柱被描述在，例如美国专利号4,627,918和4,676,898中。在水平流或径向流类型的柱中，样本和洗脱液通过分配器引入到分离介质或基质的外周或圆周壁或表面，液体水平地或径向地向内穿过分离介质到达中央或收集端口，然后以不同的时间和不同的速率从柱中洗脱。

之后，色谱柱和方法被发展为对粗进料的直接处理，来用于分离生物活性物质，所述生物活性物质包括细胞/发酵收获物、组织提取物、藻类、植物来源的细胞和物质以及血浆/血液。大珠粒色谱介质被填充到一个标准的、低压色谱柱中，该色谱柱中端板筛被替换为大孔筛(60-180pm孔)。大孔隙可防止柱堵塞。由于颗粒尺寸大，细胞物质在珠粒之间的颗粒间内腔流动，而可溶性产物会被珠粒上的官能团捕获。

传统上，细胞培养/发酵收获的生物制剂的下游处理需要两个主要操作：i)制备进料流和ii)回收和纯化。在施用至柱前，应该适当地制备样品。这既耗时又可能十分昂贵。如果需要制备样品，一般会稀释进料流以降低细胞密度、粘度和盐浓度，所有这些操作都有利于改善回收和纯化。回收涉及通过离心和/或微滤去除细胞和其他颗粒物质，以及减少初始体积的步骤，通常是超滤。由于常规的色谱介质很快被细胞碎片污染，因此纯化操作必须是无颗粒进料。

离心和过滤不仅是漫长和昂贵的操作，它们还会有损质量。从破裂的细胞中释放的蛋白酶会降解目标蛋白，进一步复杂化纯化方法发展的任务，增加纯化成本。与浓缩的细胞碎片接触的时间越长，失去的产物就会越多。

从未澄清的进料中直接捕获蛋白产品将使产品降解最小化，提高产品质量、产量和方法经济性。此外，如果将产品捕获和细胞去除步骤合并为一个单一的操作，将大大简化资本密集型回收操作。

从未澄清的进料中直接捕获产品有两种方法，所述未澄清的进料如细胞培养/发酵收获物或其他生物样品(如血浆)。一种方法提出了捕获树脂颗粒的流态化(fluidization)。通过流态化，单个颗粒被分离，使碎片能够畅通无阻地离开柱床。

这种方法存在几个问题。流态化床系统以预定的高流速运行，并且在改变柱尺寸的操作或方法上没有灵活性。该系统的缓冲液消耗量高于填充床系统，这是高价值药物产品的一个主要的成本因素，其中许多需要专门的缓冲液来对其进行纯化。柱体积与固相颗粒体积的比率非常高。由于没有足够的时间使目标分子完全扩散到固相中，这将负面地影响柱内的停留时间和结合能力。此外，颗粒会在柱床内碰撞，固相碎片会产生所谓的“细粉”，降低柱的性能和再利用。流态化床的操作也需要专门的、昂贵的硬件和色谱介质。

另一种方法是使用填充床柱来去除颗粒。由于以下原因，这一途径在很大程度上仍未得到探索。清除在填充床柱上的细胞碎片需要使用大的，最好是球形颗粒。这些颗粒在颗粒间内腔中需要足够的空间来使细胞或其他同等尺寸的颗粒离开柱子。