[发明专利]用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法

说明书

本发明描述了用于从不同生物流体中分离细胞外囊泡(EV)的方法，所述基于镍的分离方法(NBI)是快速的、可扩大规模的，并且允许在生理pH纯化尺寸上异质的EV，保持它们在溶液中的完整性和稳定性。

发明领域

本发明涉及从细胞培养基或生物流体中分离细胞外囊泡的领域。

背景

细胞外囊泡(EV)是膜状颗粒，包括外泌体(80nm-200nm)、微囊泡(100 μm-600μm)和凋亡小体(800nm-5000nm)。这种分类主要基于囊泡尺寸，但是已经针对它们的生物起源提出不同的机制。在肿瘤学中，EV具有研究肿瘤微环境的调节和免疫监督以捕获从肿瘤中释放的信息和/或生物标志物的潜力或被用作治疗剂的载体的潜力。

生物学和生物医学研究越来越多地集中于EV在不同生理和病理过程中的作用。因此，到目前为止，已经提出许多用于从生物材料中分离EV 的技术，但是其中许多技术不是非常有效的或不可标准化(Théry C等人, Curr Protoc Cell Biol,2006；Gardiner C等人,Extracell Vesicles 2016)。

迄今为止报告的用于EV分离的技术在很大程度上涉及外泌体纯化，外泌体即具有在50nm和200nm之间的尺寸的较小的EV。广泛引用的技术报告如下：

-差速超速离心(Livshits等人,Sci Rep.2015)；

-密度梯度离心(Van Deun等人,J Extracell Vesicles,2014；Iwai等人,JExtracell Vesicles.,2016)；

-微滤(Merchant等人,Proteomics Clin Appl.2010；Grant等人,J ImmunolMethods,2011；Hyun-Kyung Woo等人,ACS Nano.2017)；

-微流体(Davies等人,Lab Chip,2012；He等人,Lab Chip,2014；Kanwar 等人,LabChip,2014；Liga等人,Lab Chip,2015)；

-使用合成肽(Ghosh等人,PLoS One,2014)、肝素(Balaj等人,Sci Rep. 2015)、识别膜的抗体的组合(Pugholm等人,Biomed Res Int.2015；Cao等人,Mol Cell Proteomics,2008)、蛋白(簇分化或抗原或组分)或Tim4蛋白 (Nakai等人,Sci Rep.2016)的免疫沉淀；

-基于聚合物的沉淀/分离或基于溶剂的沉淀/分离(Deregibus等人,Int J MolMed.2016；Taylor等人,Methods Mol Biol.,2011；Gallart-Palau等人,Sci Rep.2015)；

-超声(Lee等人,ACS Nano 2015)；

-基于柱的商业化系统，包括ExoQuick^TM(System Bioscience)、总外泌体分离试剂(Thermo Fisher)、miRCURY^TM外泌体分离试剂盒(Exiqon)、 exoEasy(Qiagen)、Exo-spin^TM(Cell Guidance)、ME^TM试剂盒(NEP)。