[发明专利]用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法

权利要求书

1.用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化组合物的方法，该方法包含：

a)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的蛋白质混合物；

b)使所述蛋白质混合物经历两阶段疏水作用色谱(HIC)步骤，其包含：

将所述蛋白质混合物施加于第一种HIC材料，得到第一HIC流通溶液；和

将第一HIC流通溶液施加于第二种HIC材料，得到第二HIC流通溶液，

其中第二种HIC材料与第一种HIC材料不同；且

其中两阶段HIC步骤在两阶段HIC条件下进行，该两阶段HIC条件适合于使寡-聚乙二醇化蛋白质结合至第一种HIC材料并且使单-聚乙二醇化蛋白质结合至第二种HIC材料；并且

c)从第二种HIC材料上洗脱单-聚乙二醇化蛋白质，得到第二HIC洗脱液，其中第二HIC洗脱液提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质为激素、细胞因子、酶或抗体。

3.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。

4.根据上述权利要求任一项的方法，其中第一种HIC材料和第二种HIC材料直接以串联连接。

5.根据上述权利要求任一项的方法，其中在两阶段HIC条件下，第一种HIC材料不结合非-聚乙二醇化蛋白质或单-聚乙二醇化蛋白质，并且其中第二种HIC材料不结合非-聚乙二醇化蛋白质。

6.根据上述权利要求任一项的方法，其中在对比HIC洗脱色谱图中，第一种HIC材料和第二种HIC材料具有单-聚乙二醇化蛋白质的良好分离的峰。

7.根据上述权利要求任一项的方法，其中

a)第一种HIC材料在两阶段HIC条件下具有与Phenyl Sepharose HP基本上相同的选择性；且

b)第二种HIC材料在两阶段HIC条件下具有与Toyopearl Phenyl 650M基本上相同的选择性。

8.根据上述权利要求任一项的方法，其中

a)第一种HIC材料为Phenyl Sepharose HP；和/或

b)第二种HIC材料为Toyopearl Phenyl 650M。

9.根据上述权利要求任一项的方法，还包含下列步骤：

d)从第一种HIC材料上洗脱寡-聚乙二醇化蛋白质，得到第一HIC洗脱液。

10.根据权利要求9的方法，其中从第一种HIC材料上洗脱寡-聚乙二醇化蛋白质包含线性梯度洗脱。

11.根据上述权利要求任一项的方法，其中

i.两阶段HIC条件以约54-55mS/cm的电导率进行；和/或

ii.从第二种HIC材料上以40-41mS/cm的电导率洗脱单-聚乙二醇化蛋白质；和/或

iii.从第一种HIC材料上洗脱寡-聚乙二醇化蛋白质通过约54-55mS/cm-约1-5mS/cm的线性梯度进行；

并且其中任选地所述蛋白质为EPO。

12.根据上述权利要求任一项的方法，其中该方法采用缓冲液A和缓冲液B的混合物进行，其中缓冲液A包含25mM HEPES、pH 7.5、500mM Na₂SO₄，并且其中缓冲液B包含25mMHEPES、pH 7.5，并且其中

i.两阶段HIC条件以约13.5％的缓冲液B进行；和/或

ii.从第二种HIC材料上以约40％的缓冲液B洗脱单-聚乙二醇化蛋白质；和/或

iii.从第一种HIC材料上洗脱寡-聚乙二醇化蛋白质通过约13.5％-约80％的缓冲液B的线性梯度进行；

并且其中任选地所述蛋白质为EPO。