[发明专利]使用CRISPR的高效体内敲入

权利要求书

1.一种在宿主细胞基因组中选定基因座处插入所需基因的方法，其中所述宿主细胞在活生物体内，所述方法包括：

使活生物体与以下项接触：

(i)供体载体，其编码所需基因和一个或两个sgRNA靶位点；

(ii)基因座特异性辅助载体，其编码至少一个小指导RNA(sgRNA)，所述小指导RNA与宿主细胞基因组中的选定核酸序列互补；

(iii)通用型辅助载体，其编码至少一个sgRNA，所述sgRNA与供体载体中的一个或两个sgRNA靶位点互补；和

如果所述基因座特异性辅助载体或通用型辅助载体不编码Cas或Cpfl蛋白时的(iv)Cas或Cpfl蛋白，

从而使所述供体载体线性化以形成供体DNA片段，从而使所述供体DNA片段通过NHEJ介导的敲入进入到所述活生物体的宿主细胞基因组中。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体进一步包含在所需基因5’末端处的内部核糖体进入位点(ires)元件。

3.如权利要求1所述的方法，其中在所选基因座的3’UTR处插入所需基因，并且其中至少一个由所述基因座特异性辅助载体编码的小指导RNA(sgRNA)与所选基因座3’UTR处的选定的核酸序列互补。

4.如权利要求1所述的方法，进一步包括从获得自活生物体的样品检测由插入的所需基因编码的蛋白质或RNA。

5.如权利要求1所述的方法，进一步包括从获得自活生物体的样品评估插入的所需基因的功能性。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体包含一个或两个sgRNA靶位点。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体包含一个或多个所需基因。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述基因座特异性辅助载体编码Cas9。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述通用型辅助载体编码Cas9。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体、基因座特异性辅助载体和/或通用型辅助载体选自质粒、AAV病毒颗粒、腺病毒颗粒、慢病毒颗粒和DNA纳米颗粒复合物。

11.如权利要求1所述的方法，其中将所述供体载体、基因座特异性辅助载体和通用型辅助载体作为AAV病毒颗粒进行递送。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞在活生物体的肝内。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是造血干细胞。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述活生物体是患有遗传性疾病的人。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述活生物体是患有糖尿病的人。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体包含hINS基因和一个或两个sgRNA靶位点。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述活生物体是患有乙型血友病的人。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述供体载体包含hF9基因和一个或两个sgRNA靶位点。

19.如权利要求1所述的方法，其中所选基因座是Actb、Alb或GAPDH。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个指导RNA包含约20个核苷酸的核酸区，其与宿主细胞基因组中的所选核酸序列互补。