[发明专利]用于治疗MMA的非破坏性基因疗法

权利要求书

1.一种将转基因整合到受试者的组织中的至少一个细胞群的基因组中的方法，所述方法包括

向受试者施用递送编码功能蛋白的转基因的组合物，所述受试者的组织中的细胞不能表达由基因产物编码的所述功能蛋白，其中所述组合物包括：

多核苷酸盒，其包括

第一核酸序列和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列编码所述转基因；并且所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列的5'或3'，并在整合到所述细胞的基因组中的靶整合位点后促进两个独立的基因产物的产生；

第三核酸序列，其位于所述多核苷酸的5'，并包括与所述细胞的基因组中的所述靶整合位点的5'的基因组序列基本同源的序列；以及

第四核酸序列，其位于所述多核苷酸的3'，并包括与所述细胞的基因组中的所述靶整合位点的3'的基因组序列基本同源的序列；

其中，在施用所述组合物后，所述转基因整合到所述细胞群的基因组中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述整合不包括核酸酶活性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括重组病毒载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组病毒载体是重组AAV载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述重组病毒载体是或包括衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包括与LK03、AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03或AAVNP59的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因是或包括MUT转基因。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包括AAV2 ITR序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸盒不包括启动子序列。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述多核苷酸盒整合到所述细胞的基因组中的所述靶整合位点后，所述转基因在所述靶整合位点的内源性启动子的控制下表达。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶整合位点是包括内源性白蛋白启动子和内源性白蛋白基因的白蛋白基因座。

11.根据权利要求10所述的方法，其中在所述多核苷酸盒整合到所述细胞的基因组中的所述靶整合位点后，所述转基因在所述内源性白蛋白启动子的控制下表达，而不破坏所述内源性白蛋白基因的表达。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织是肝脏。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二核酸序列包括：

a)2A肽；

b)内部核糖体进入位点(IRES)；

c)N端内含肽剪接区和C端内含肽剪接区；或

d)剪接供体和剪接受体。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列是同源臂，其将所述转基因和所述第二核酸序列整合到包括内源性白蛋白启动子和内源性白蛋白基因的内源性白蛋白基因座中。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述同源臂引导所述多核苷酸盒整合到紧靠所述内源性白蛋白基因的起始密码子的3'或紧靠所述内源性白蛋白基因的终止密码子的5'。

16.根据权利要求6所述的方法，其中所述MUT转基因是野生型人类MUT、密码子优化的MUT、合成MUT、MUT变异体、MUT突变体或MUT片段。