[发明专利]一株根瘤菌寻配专一性高效共生苜蓿品种的方法

权利要求书

1.一株根瘤菌寻配专一性高效共生苜蓿品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培育苜蓿品种幼苗：挑选子粒饱满、健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全柜内用碘伏溶液(有效碘含量0.45％～0.55％(W·V^-1))震荡灭菌3min，用无菌水冲洗5～6次，于清水琼脂中28℃催芽48h；将河沙洗净，过筛(2-mm)，pH调至中性后105℃烘干，121℃灭菌6h，冷却；在直径13.2cm、高10cm的塑料盆中装入河沙450g，并均匀植入60粒种子发芽，深度为2cm；之后将塑料小盆放入29cm×20cm×9.5cm的塑料面盆中，每个面盆内放2个小盆，并浇灌500mL灭菌水；实验室培养条件为：光照时间12h·d^-1，有光照时温度21～25℃，无光照时温度16～20℃，相对湿度45±5％；在第7d浇灌500mL Hoagland有氮营养液；

2)制备菌液：将根瘤菌株TY平板活化后转接入50mL TY液体培养基，28℃、180rpm·min^-1振荡培养至菌液光密度OD₆₀₀nm值为0.5～1，4000rpm·min^-1离心5min，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD₆₀₀nm为0.5的根瘤菌液；

3)接种根瘤菌株：在幼苗生长至第15d左右时，即第1片真叶出现，用移液器将制备好的菌液加入幼苗根部，每小盆30mL，以不含根瘤菌的TY液体培养基为对照；每个菌株处理4个小盆作为重复；接种后每隔7d在塑料面盆中浇灌Hoagland无氮营养液500mL；其余时间用灭菌蒸馏水补充水分；

4)测定指标：根瘤菌株接种45d后，即植株已生长60d，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分；每盆随机取10株，测定单株结瘤数、有效根瘤重、根瘤直径、根瘤等级、根瘤固氮酶活性、单株叶片数、株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重、叶绿素含量和粗蛋白含量；

5)确定共生效应代表性指标：对步骤4)测定的14个指标进行主成分分析，选择第一主成分中贡献率最大的指标，代表根瘤菌株与紫花苜蓿品种的共生效应；

6)共生效应类型划分：当根瘤菌株接种紫花苜蓿品种的结瘤共生效应指标值显著高于未接种处理CK时(P<0.05)，其效应标记为“正效应”，表明根瘤菌与紫花苜蓿品种共生产生显著地生长正效应；当根瘤菌株与紫花苜蓿品种共生效应与CK差异不显著时(P>0.05)，其共生效应标记为“无效应”，表明根瘤菌株与紫花苜蓿品种共生结瘤对苜蓿生长不产生效应；当根瘤菌株与紫花苜蓿品种的结瘤共生效应显著低于CK时(P<0.05)，其共生效应标记为“负效应”，表明根瘤菌与紫花苜蓿品种植株共生产生负效应。

7)确定专一性共生苜蓿品种：当根瘤菌株接种的紫花苜蓿品种共生效应标记为“正效应”时，确定该紫花苜蓿品种为根瘤菌株的专一性共生正效应紫花苜蓿品种；标记为“无效应”时，确定该紫花苜蓿品种为根瘤菌株的共生无效应紫花苜蓿品种；标记为“负效应”时，确定该紫花苜蓿品种为根瘤菌株的专一性共生负效应紫花苜蓿品种。

2.根据权利要求1所述的一株根瘤菌寻配专一性高效共生苜蓿品种的方法，其特征在于，菌株使用高效结瘤固氮根瘤菌株；苜蓿品种为根瘤菌株来源地区长期种植和适宜种植的紫花苜蓿品种。

3.根据权利要求1所述的一株根瘤菌寻配专一性高效共生苜蓿品种的方法，其特征在于TY培养基的制备方法为：胰蛋白胨5g·L^-1；酵母粉3g·L^-1；CaC₁₂·6H₂O 1.3g·L^-1；调pH至7.0；121℃灭菌26min。