[发明专利]一种小胶质细胞的培养方法在审
| 申请号： | 201910001835.1 | 申请日： | 2019-01-02 |
| 公开（公告）号： | CN109609459A | 公开（公告）日： | 2019-04-12 |
| 发明（设计）人： | 林丽;胡健;王雪;朱丽云 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学;杭州生物医药创新研究中心 |
| 主分类号： | C12N5/079 | 分类号： | C12N5/079 |
| 代理公司： | 杭州之江专利事务所(普通合伙) 33216 | 代理人： | 张勋斌 |
| 地址： | 325000 浙江省温州市瓯海经济*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 小胶质细胞 大脑皮层 混合细胞 大脑皮层组织 成纤维细胞 消化 大鼠新生 分离步骤 胶质细胞 生长环境 综合考虑 铺板 消化液 剪碎 胰酶 过滤 体内 | ||
1.一种小胶质细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离大鼠新生鼠的大脑皮层组织，将组织剪碎、加HBSS离心分离、消化液消化、终止消化、过滤得到大脑皮层混合细胞；
(2)将步骤(1)大脑皮层混合细胞铺板培养，过程如下：
一只新生鼠大脑皮层混合细胞铺一块六孔板，培养时，先采用DMEM/F12完全培养基，六孔板每孔加2ml培养基，将细胞放置于5％CO2,37℃培养箱培养，每隔三天完全换液；培养至第九天换液时，用混合培养基代替所述的DMEM/F12完全培养基进行培养，所述的混合培养基由DMEM/F12完全培养基和F-CM条件培养基制成；每三天完全换液，每孔加入2ml混合培养基，培养至第十二或第十四天进行分离；
(3)分离步骤(2)培养得到的小胶质细胞。
2.根据权利要求1所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，消化液为0.25％不含EDTA的胰酶。
3.根据权利要求1所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的混合培养基中，DMEM/F12完全培养基和F-CM条件培养基的质量比为75：25。
4.根据权利要求1所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的F-CM条件培养基的制备方法如下：
培养3T3细胞至80-90％汇合，PBS清洗，换液，继续培养24h收集上层培养基，10min，3000g离心去除细胞碎片，得到所述条件培养基，-20℃贮存备用。
5.根据权利要求1所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，分离过程如下：
弃去培养基，用不含FBS的DMEM/F12清洗一次,每孔加入1mL消化液放置于培养箱消化30min，等到上层细胞膜完全剥离加入完全培养基终止消化，弃去上层含膜液体，加入完全培养基培养，贴壁细胞即为小胶质细胞。
6.根据权利要求5所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，所用的消化液由0.25％含EDTA胰酶和DMEM/F12组成，质量比为1：3。
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