[发明专利]一种胰岛素DesB30的制备方法

说明书

本发明公开了一种胰岛素DesB³⁰的制备方法，包括以下步骤：S1、向胰岛素前体蛋白的发酵液中添加蛋白酶；S2、调节所述步骤S1处理后的溶液的pH值和温度使蛋白酶进行酶切，酶切后得到含有胰岛素DesB³⁰的溶液。所述制备方法还可以包括步骤S3、对酶切后的含有胰岛素前体的溶液进行等电点沉淀回收操作，得到纯度更高的胰岛素DesB³⁰。与现有技术相比，通过本发明方案制备胰岛素前体操作简便、设备投入低且工艺过程收率高，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种胰岛素DesB³⁰的制备方法。

背景技术

胰岛素是糖尿病治疗过程中的重要药物之一，目前，市场生产的胰岛素主要采用重组技术，重组胰岛素的生产过程通常包括以下几个步骤：S1、通过微生物如大肠杆菌或酵母菌等表达胰岛素原；S2、通过纯化后去除发酵液中的大部分杂质；S3、通过胰蛋白酶或赖氨酰内切酶酶切获得去B链30位氨基酸残基的胰岛素(DesB³⁰胰岛素)固体粉末；S4、对上述操作得到的DesB³⁰胰岛素进行不同的修饰得到功效不同的重组胰岛素衍生物，如通过转肽反应等工艺可以获得起效迅速的门冬胰岛素；或通过不同脂肪酸侧链的修饰可以获得长效的地特胰岛素或德谷胰岛素。

其中，步骤S2中胰岛素原纯化方式通常采用阳离子交换层析，通过使用在酸性条件下，0.5～1.0M NaCl进行洗脱获得胰岛素或胰岛素类似物前体。这种方式得到的人胰岛素类似物前体存在的大量无机盐会严重抑制胰蛋酶的活性，往往需要进一步脱盐、加大酶量或延长酶切时间来调控酶切效率。此外，步骤S1利用微生物(如大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等)发酵平台，获得大量的表达胰岛素时不仅会产生大量色素，而且发酵液中残留的无机盐含量非常高，电导率值可达到40-50mS/cm，因此，在进行纯化时对发酵上清液进行超滤换液或适当稀释来降低电导，以实现胰岛素前体结合层析填料进而实现分离纯化。中国发明专利文件CN105111304B公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切换方法，具体公开了采用离子交换对胰岛素原发酵液进行纯化，然后通过加入有机溶剂乙腈并进行酶切，随后旋蒸出有机溶剂并等电点沉淀获得DesB³⁰胰岛素，该方法虽能得到纯度相对较高的胰岛素前体，然而工艺整体却十分繁琐，且整体摩尔收率只有约80%。中国发明专利文件CN1699412B公开了一种胰岛素及胰岛素类似物的基因工程制备新方法，具体公开了应用XAD-7疏水吸附填料分离纯化--旋蒸除有机试剂--凝胶过滤除去色素和部分杂质，然后利用阳离子交换柱SP-Fast flow除去多脂类等杂质，收集的胰岛素前体的工艺，该方法也能提升产品纯度，然而其所采用的工艺步骤长、有机试剂消耗大、疏水吸附层析交换容量低、脱盐步骤产率低，不适合大规模的生产。中国发明专利申请文件CN105153294A公开了一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，具体公开了采用更先进的可以耐受高电导率的离子交换填料进行胰岛素前体的回收，如采用Capto MMC可以在几乎不稀释发酵液的情况下直接进行纯化，且收率有85%左右，但类似填料价格往往是常用离子交换填料的5倍以上，导致其生产成本大大增加，仍不适用于工业化大规模生产。

综上所述，现有技术中采用重组表达法制得的胰岛素前体在制备DesB³⁰胰岛素过程中存在着常规层析填料前体纯化过程不能耐受高盐上样、超滤换液脱盐、大体积稀释、高盐洗脱后与后续酶切工艺衔接困难等诸多问题，而非常规疏水填料在层析中则存在有机试剂用量大、填料成本高、污染严重等问题。因此，如何简单方便的制备胰岛素前体(DesB³⁰胰岛素)以使其适合于工业生产是目前胰岛素类似物制备过程中亟待解决的重要问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简便且工艺过程收率高的胰岛素前体的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种胰岛素前体的制备方法，包括以下步骤：