[发明专利]一种重组质粒pZQ12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-PHA的重组菌及其应用

权利要求书

1.一种重组质粒pZQ12，其特征在于，cimA基因插入到质粒pACYCDuet-1的NcoI和BamHI多克隆位点处；leuBCD基因插入到质粒pACYCDuet-1的BamHI和SacI多克隆位点处；ilvA基因插入到质粒pACYCDuet-1的SacI和AscI多克隆位点；thrA*BC基因插入到质粒pACYCDuet-1的AscI多克隆位点处；

所述cimA基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述leuBCD基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述ilvA基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

所述thrA*BC基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述重组质粒pZQ12的制备方法，包括如下步骤：

1)采用NcoI和BamHI分别对质粒pACYCDuet-1和cimA基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1和cimA基因；

2)将所述步骤1)的酶切后的pACYCDuet-1和cimA基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA；

3)采用BamHI和SacI分别对所述步骤2)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因；

4)将所述步骤3)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD；

5)采用SacI和AscI分别对所述步骤4)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因；

6)将所述步骤5)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA；

7)采用AscI分别对所述步骤6)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因进行单酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因；

8)将所述步骤7)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因连接，得到重组质粒pZQ12。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中cimA基因的制备方法包括如下步骤：

a.提取甲烷细菌MB1的总DNA；

b.以所述步骤a的总DNA为模板，采用引物cimA-F和cimA-R扩增cimA基因，得到cimA基因；

所述引物cimA-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

所述引物cimA-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中leuBCD基因的制备方法包括如下步骤：

(1)提取大肠杆菌MG1655的总DNA；

(2)以所述步骤(1)的总DNA为模板，采用引物leuBCD-F和leuBCD-R扩增leuBCD基因，得到leuBCD基因；

所述引物leuBCD-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；

所述引物leuBCD-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中ilvA基因的制备方法包括如下步骤：

①提取荧光假单胞菌PICF7的总DNA；

②以所述步骤①的总DNA为模板，采用引物ilvA-F和ilvA-R扩增ilvA基因，得到ilvA基因；

所述引物ilvA-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；

所述引物ilvA-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。