[发明专利]高度选择性核酸扩增引物

权利要求书

1.一种区分突变体DNA靶序列和密切相关的野生型DNA靶序列的多部分核酸扩增引物，所述引物以5'-3'方向包含以下三个连续的DNA序列：

锚定序列，其能够与突变体靶序列和与野生型靶序列形成长15-40个核苷酸的杂交体；

桥序列，其长至少6个核苷酸并且不与突变体靶序列或野生型靶序列任一个互补；以及

足序列，其长5-7个核苷酸，

其中突变体靶序列与足序列完全互补，并且野生型靶序列与足序列具有足序列3'的核苷酸或3'倒数第二个核苷酸中至少一个核苷酸的错配，以及

其中，如果引物的锚定和足序列与突变体靶序列或与野生型靶序列杂交，则在靶序列中有至少六个核苷酸长的插入序列，所述插入序列不与引物的桥序列杂交，并且桥序列和插入序列一起形成杂交体中的泡，所述泡具有16-52个核苷酸的周长。

2.根据权利要求1所述的引物，其含有位于锚定序列5'的功能部分，所述功能部分不与突变体靶序列或不与野生型靶序列杂交。

3.根据权利要求3所述的引物，其中功能部分含有荧光团并产生指示扩增的荧光信号。

4.根据权利要求1所述的引物，其中足序列长6-7个核苷酸。

5.根据权利要求4所述的引物，其中锚定序列能够与突变体靶序列和与野生型靶序列形成长15-30个核苷酸的杂交体。

6.根据权利要求5所述的引物，其中泡具有28-44个核苷酸的周长。

7.根据权利要求6所述的引物，其中桥序列和插入序列具有相等的长度。

8.根据权利要求1所述的引物，其中泡具有28-44个核苷酸的周长。

9.一种能够在含有每个突变体靶序列的密切相关的野生型DNA靶序列的混合物中扩增至少一个稀有的突变体DNA靶序列的扩增和检测方法，其包括在具有引物-退火温度的引物依赖的扩增反应中重复循环反应混合物，并检测扩增的产物，所述反应混合物包括所述至少一个突变体靶序列或其密切相关的野生型靶序列或二者都有、DNA聚合酶、扩增所需的其它试剂，以及针对每个突变体靶序列的包括多部分引物的引物对，所述多部分引物以5'-3'方向包含以下三个连续的DNA序列：

锚定序列，其在引物-退火温度与突变体靶序列和与其密切相关的野生型靶序列杂交；

桥序列，其长至少6个核苷酸并且不与突变体靶序列或其密切相关的野生型靶序列任一个互补；以及

足序列，其长5-7个核苷酸，

其中，突变体靶序列与足序列完全互补，并且密切相关的野生型靶序列与足序列具有足序列3'的核苷酸或3'倒数第二个核苷酸中至少一个核苷酸的错配，

其中，如果引物的锚定序列和足序列与突变体靶序列或与其密切相关的野生型靶序列杂交，则在靶序列中有至少六个核苷酸长的插入序列，所述插入序列不与引物的桥序列在引物-退火温度杂交，并且桥序列和插入序列一起形成杂交体中的泡，所述泡具有16-52个核苷酸的周长，以及

其中，在所述循环过程中，多部分引物/野生型靶序列杂交体将被延伸的概率至多为在所述循环的过程中多部分引物/突变体靶序列杂交体将被延伸的概率的1/1,000。

10.根据权利要求9所述的方法，其中至少一个突变体靶序列为cDNA。

11.根据权利要求9所述的方法，其中足序列长6-7个核苷酸。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述循环的过程中，多部分引物/野生型靶序列杂交体将被延伸的概率至多为在所述循环的过程中多部分引物/突变体靶序列杂交体将被延伸的概率的1/10,000。

13.根据权利要求12所述的方法，其中泡具有28-44个核苷酸的周长。