[发明专利]一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法

权利要求书

1.一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行:

（1）基因组DNA提取；

（2）抗感品种的PCR片段克隆：

利用Sm-Indel-F /R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20-60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5^，端引物（10 µmol/L）2.5μL，3^，端引物（10µmol/L ）2.5μL；

PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增；

循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆；所述的引物指的是：

Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG ；

Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG；

（3）抗性基因特异性引物的设计

因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计HRM特异性的引物；

（4） HRM反应体系

PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL,20×Evagreen 1uL，5^，端引物（10µmol/L）0.4μL，3^，端引物（10µmol/L ）0.4μL，PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环，扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95 ℃的过程中，以25 次 ·-1 ℃的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃，利用LightCycler®480 的Gene Scanning 1.5 version 软件进行高分辨率熔解曲线分析；所述的引物指的是：

Smhrm2F：GATCTCATCCCGTTGTATATGC

Smhrm2R GCAAAGACAT GACTAAACTCT。

2.权利要求1所述的鉴定番茄灰叶斑抗性基因方法在加快抗病材料和品种选育速度方面的应用。