[发明专利]一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一株生产高分子量透明质酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus subtilis；命名为BH-2菌株；已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号CGMCCNo.16841。

2.一种权利要求1所述工程菌在生产透明质酸中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

a)配制发酵培养基成分；

b)挑BH-2菌株单菌落于LB+TetR液体培养基中，摇瓶培养；

c)取摇瓶培养的BH-2菌液于发酵培养基中发酵；

d)收集发酵液，离心，取上清于另一离心管中，加入无水乙醇充分混匀，室温下静置,再离心，去除上清，晾干沉淀；加入与发酵液等体积蒸馏水充分溶解，采用硫酸-咔唑法测定透明质酸含量；

e)溶解后的发酵产物透析后，用多角度激光光散射仪测定分子量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，

步骤a)所述发酵培养基成分为：

20.0g蔗糖

3.0g(NH₄)₂SO₄

6.5gKH₂PO₄

4.5gNa₂HPO₄

2.0g柠檬酸钠

3.0gMgSO₄·7H₂O

0.5gCaCl₂·2H₂0

6.0ml微量金属溶液

其余为水；

其中，1L所述微量金属溶液成分为：

100g柠檬酸

20gFeSO₄·7H₂O

5gMnSO₄·H₂O

2gCuSO₄·5H₂O

2gZnCl，其余成分为水；

步骤b)中，挑BH-2菌株单菌落于5mLLB+TetR液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；

步骤c)中，取1mL过夜培养的BH-2菌株于发酵培养基中，37℃、27℃、32℃、42℃或47℃，200rpm培养54h；

步骤d)中，收集发酵液，10000rpm离心15min，取上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇充分混匀，室温下静置1h，再10000rpm离心20min，去除液体，晾干沉淀；加入与发酵液等体积蒸馏水充分溶解，采用硫酸-咔唑法测定透明质酸含量；

步骤e)中，溶解后的发酵产物透析2-3d，过0.22μ m滤器，用多角度激光光散射仪测定分子量。