[发明专利]一种用于批量制备微量细胞裂解液的保存方法及其应用

说明书

本发明为一种用于批量制备微量细胞裂解液的保存方法，包括如下步骤：(1)将甘油、DMSO或两者的混合物加入到Trizol或者TCL buffer裂解液中并混匀；(2)用含上述添加剂的Trizol或者TCL buffer裂解液按一定体积加入到96孔板或者384孔板中裂解细胞或者组织，必要时用移液器吹打或其他工具进行混匀；(3)迅速将细胞或者组织裂解液的孔板放在‑20℃～80℃冰箱保存；(4)在保存一段时间后，将细胞或组织裂解液孔板从冰箱中取出，溶解后吸取细胞或组织裂解液进行RT‑PCR；(5)通过电泳检测。该方法通过单独添加不同比例的甘油或者不同比例的DMSO，或者以不同比例将甘油和DMSO混合后再添加的方法，解决了结晶和污染的问题。

技术领域

本发明属于生物科技领域；更具体地，本发明报道了一种用于批量制备微量细胞裂解液的保存方法及其应用，以便后续从中提取核酸用于开发重组单克隆抗体。

背景技术

核酸是分子生物学研究中核心材料，是基因信息的载体。因此制备和保存核酸是分子生物学实验中的关键环节。核酸中的信使RNA(mRNA)是携带遗传信息并能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸，在遗传信息的传递过程尤其是从核酸到蛋白的翻译过程中发挥着不可或缺的作用。但是，信使RNA由于是以单链形式存在非常不稳定，并且容易受到环境中RNAase(核糖核酸酶)的污染和降解。因此，在实验中需要尽快将细胞或者组织进行处理，破坏掉细胞或组织中内源性的RNAase(核糖核酸酶)，防止信使RNA被降解。

现在普遍采用的细胞裂解和保存的方法主要是Trizol或在其基础上改进的其他方法，比如Qiagen的TCL buffer(Qiagen Cat No./ID:1031576；Cat No./ID:1070498)。Trizol和TCL buffer的主要成分是异硫氰酸胍(guanidine thiocyanate，GITC)和苯酚(USpatents 4,843,155and 5,346,994)。使用时将Trizol或TCL buffer与细胞或组织以一定比例混合，或直接进行实验或低温(-20℃～80℃)保存。

现代生物科技工业化进程已经发展到自动化和高通量的阶段，样品多样性丰富，但样品量稀少。这些样品大多少被保存在96孔板或者384孔板，以满足自动化和高通量的需求。在另一发明《一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法》(申请号201610724209.1)中公开了一种高通量分离B细胞的方法，通过该方法分离得到的B细胞种类多、数量少，为了满足高通量的要求需要将B细胞保存在96孔板或者384孔板中。

由于Trizol的中的异硫氰酸胍和其他成分，比如SDS的存在，导致在低温环境中细胞或组织裂解液部分或者全部产生结晶。当这种细胞或组织裂解液以微量形式存在时，比如96孔板或者384孔板，由于孔板的密封性较低、空间距较小，这种结晶会生长并延申到相邻孔，从而导致相邻孔的裂解液交叉污染。从而导致假阳性或者假阴性，给科研和生产带来非常大的困扰。因此，急迫需要解决这种低温下裂解液结晶的问题，使科研和生产活动更加高效和可靠。

甘油是一种有机物，化学名为丙三醇，国家标准称为甘油，无色、无臭、味甜，外观呈澄明黏稠液态。化学性质稳定、安全无毒，常用于医疗、食品和化妆品中，起到吸湿、润滑和防冻等做用。

DMSO是一种含硫有机物，化学名为二甲基亚砜，常温下为无色无臭的透明液体。化学性质稳定，可以和水以及绝大多数有机溶剂互溶，被誉为“万能溶剂”。纯DMSO的冰点是18.45℃，含水40％的DMSO在-60℃不冻，在医疗上常用于骨髓、血液、低温保存的防冻剂等。

发明内容

本发明针对细胞或组织裂解液在低温保存条件下会产生结晶造成孔间污染的问题，提供一种用于细胞或组织裂解和保存的方法，该方法通过单独添加不同比例的甘油或者不同比例的DMSO，或者以不同比例将甘油和DMSO混合后再添加的方法，解决了结晶和污染的问题。

本发明提供如下技术方案：一种用于批量制备微量细胞裂解液的保存方法，包括如下步骤：