[发明专利]胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g及其制备方法与应用

说明书

一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g及其制备方法与应用，所述胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g来源于黑曲霉CBS513.8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的AnLPMO14g可单独作用于纤维素类底物，对其糖苷键进行C1位氧化切割产生还原糖，该酶与纤维素酶协同作用，可分别提高纤维素酶降解微晶纤维素和草粉的还原糖产量。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g及其制备方法与其应用。

背景技术

木质纤维素是地球上含量最丰富的可再生生物质资源，是生物质能源研究的热点领域。木质纤维素生物质可以通过水解和发酵转化为生物乙醇等生物燃料以及其他生物基产品。木质纤维素生物质的微生物转化主要包括3个过程：预处理、酶解和发酵，其中酶解过程是决定木质纤维素生物质微生物转化成本的关键步骤。木质纤维素的酶解需要多种酶的共同作用，主要包括纤维素酶，半纤维素酶、木质素酶等。但是，木质纤维素复杂的网状结构构成了阻碍其被高效酶解的天然屏障，降低了纤维素酶和半纤维素酶的作用效率。

为了提高酶解效率，近年来，膨胀素、CBM模块、AA9家族裂解性多糖单加氧酶(LPMO)等辅助蛋白进入了人们的视野。其中，AA9家族LPMO是最具有应用潜力的一种辅助蛋白。AA9家族多糖单加氧酶主要来源于真菌，尤其是丝状真菌，可以借助金属离子和还原型电子供体氧化断裂纤维素底物的多糖链，为纤维素酶提供更多的结合位点，从而提高木质纤维素的降解效率。目前，已报道的AA9的来源仍然有限，开发新的来源的AA9家族多糖单加氧酶对AA9的研究以及提高木质纤维素的酶解效率有很重要的意义。黑曲霉作为一种应用广泛的糖苷水解酶分泌型真菌，含有多个编码AA9家族多糖单加氧酶的基因，但是目前尚未有相关研究报告，因此，黑曲霉AA9家族多糖单加氧酶具有重要研究价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g及其制备方法与应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g，所述胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，其来自于黑曲霉CBS513.88。

本发明还提供一种包含上述胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g的核苷酸序列的重组载体pPIC9k-An14g02670。

本发明还提供一种上述重组载体pPIC9k-An14g02670的制备方法，包括如下步骤：

S1：以黑曲霉CBS513.88的基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物作为扩增引物，进行PCR扩增，得到胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g基因片段；

S2：用EcoR I和Not I分别对pPIC9k载体和胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g编码基因片段进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切后的pPIC9k载体和胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g编码基因片段连接，转化，提取质粒，得到重组载体。

进一步地，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-GCGCGAATTCCACGGTCACGTCACTAACCTCGTCGT-3’；

下游引物：5’-TATATGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGAGCACTAGCAATGCACTGGTAGTAGTA-3’。

本发明还提供一种包含上述重组载体pPIC9k-An14g02670的重组毕赤酵母工程菌株GS115-AnLPMO14g。