[发明专利]稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株及其构建和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及稳定表达CD63‑GFP的PK‑15细胞株及其构建和应用，所述细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C2018253。构建方法包括以下步骤：目的基因合成、目的基因和慢病毒载体双酶切、重组质粒构建和鉴定、转染293T细胞、感染PK‑15细胞、细胞株筛选验证。采用本发明方法构建的稳定表达CD63‑GFP的PK‑15细胞株可用于细胞内、外的外泌体含量评估。利用本发明构建的稳定表达CD63‑GFP融合蛋白的PK‑15细胞株，可用荧光观察绿色荧光蛋白或通过流式细胞仪方便地评估外泌体的分泌量。该细胞株的建立为研究外泌体在病毒感染PK‑15细胞时的应用提供了可靠材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株及其构建和应用。

背景技术

外泌体是细胞内生成并分泌到胞外的一类直径30～150nm的双层膜囊泡，其主要成分为蛋白质、脂质、核苷酸。外泌体最初被认为是从细胞中排泄细胞废物的载体，但是，越来越多的证据支持外泌体通过转运核酸、脂质和蛋白质等多种物质，影响受体细胞的命运，在细胞间通讯中起作用。2007年首次研究发现外泌体可作为细胞间信息交流的信使，后续研究发现外泌体在宿主免疫应答、病原感染以及肿瘤的发生发展中扮演重要角色。外泌体携带病原体相关成分促进病原体的传播，或者诱发机体天然免疫或适应性免疫反应。

评价外泌体含量的方法主要有WB、ELISA检测外泌体标志蛋白，纳米粒径计数，流式计数，ACHE活性检测，检测总蛋白量。上述方法均需要先将外泌体分离、浓缩、纯化，中间步骤繁琐，增加了实验结果的不确定性。

目前大量研究集中于外泌体的分离鉴定方法以及功能研究，但病毒感染过程中，外泌体可以携带病毒基因组、蛋白或相关核酸，免受中和抗体干扰和受体限制，进入细胞发挥作用。但很少有研究报道病毒感染对外泌体分泌量的影响。并且，外泌体大小差不多涵盖了病毒本身的大小，加上很多病毒是裂解性复制，很难鉴定外泌体是由细胞分泌还是由细胞裂解产生，对外泌体的分离纯化造成极大干扰。

关于外泌体的定量方法目前没有金标准，外泌体精确定量是研究外泌体生物功能的基础，简单、快捷的外泌体定量方法，将有利于外泌体的研究和应用。因此如何直观、精确评估外泌体分泌量显得尤为重要。CD63被称为溶酶体相关膜蛋白3，是跨膜蛋白，其大量存在于晚期内体或多泡小体中，参与膜组织和与病毒相互作用是外泌体的一个标志蛋白。

中国发明专利(CN105671082A)公开了“一种表达外泌体标记物的慢病毒载体及其构建方法和应用”，其是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位点XbaI和NotI区域分别引入带SBP标签的CD63和CD9基因，同时在引入的CD63和CD9基因后面添加荧光能力极强的绿色荧光蛋白基因ZsGreen1，构建pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro重组慢病毒载体；并公开了该慢病毒载体在细胞系构建以及CD63和CD9外泌体SBP亲和纯化上的应用，但并没有应用于外泌体的定量分析。

傅煜轩构建了能够稳定表达CD63-荧光素酶融合蛋白的Hela和HT-29细胞系用来检测病毒感染细胞后的外泌体分泌情况，与WB和纳米粒径计数方法结果一致(傅煜轩.外泌体介导的miR-146a通过抑制Ⅰ型干扰素产生进而促进肠道病毒71型复制[D]；南京大学,2018.)，该文章建立的是Hela和HT-29细胞系，未涉及到PK-15细胞系；另外该文章中与CD63融合表达的是荧光素酶，荧光素酶必须使用特定仪器检测，无法直接观察。

发明内容

本发明目的在于提供稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株及其构建和应用。该细胞株可用于评估细胞外泌体的分泌量。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株的构建方法，包括以下步骤：