[发明专利]一种FnCpf1介导的体外DNA编辑试剂盒

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cpf1系统的体外DNA编辑试剂盒，其特征在于：它含有如下组分：

DNA片段1、DNA片段2、CrRNA模板DNA与T7 RNA聚合酶；还含有Cpf1酶、RNase抑制剂、T4DNA连接酶；所述Cpf1酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的Cpf1突变体；

其中：DNA片段1由a、b、c三段串联组成，a、c段分别为CrRNA的识别切割区；b段为待拼接的核酸序列1；

CrRNA的识别切割区为PAM位点和长度为23bp的任意序列连接而成；

DNA片段2由d、e、f三段串联组成，其中，e段为待拼接的核酸序列2，d、f段分别为CrRNA的识别切割区，d、f剪切后的末端分别与a、c互补；

CrRNA模板DNA：由T7启动子、DR、spacer序列组成，DR为19或36nt，spacer序列长度为23nt；

T7启动子序列：GAAATTAATACGACTCACTATAGG；

19nt的DR序列：AATTTCTACTGTTGTAGAT；

36nt的DR序列：GTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGAT。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：DNA片段1、2均可以是环状质粒或线性DNA；

CrRNA模板DNA的条数为1条以上，spacer序列分别与a、c、d、f的23nt长度识别区一致。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还含有T7 RNA聚合酶转录相关试剂，所述相关试剂包含转录buffer和NTP(A+U+C+G)。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：转录buffer包含下述组分：100mM pH8.0的Tris-HCl、10mM MgCl₂、30mMDTT、2mM亚精胺、10％二甲亚砜。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述T7 RNA聚合酶及转录相关试剂来源于基于T7 RNA聚合酶的体外高效转录试剂盒。

6.权利要求1-5任意一项所述的试剂盒在基因编辑中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述基因编辑包含基因敲除、基因突变、靶向基因激活/抑制、DNA连接、DNA多片段组装、DNA片段插入、DNA片段替换、碱基替换。

8.一种基于CRISPR/Cpf1系统的DNA连接方法，其特征在于：使用权利要求1-5任意一项所述的试剂盒进行连接，步骤如下：

(1)制备反应体系：每20μl体系中，包含如下组分：

余量为RNase free H₂O；

(2)进行如下反应程序：

a、37℃，1h-8h

b、37℃，5-10min

c、16℃，5-10min

d、重复b和c步骤6-15次；

e、50℃，10min；

f、65℃，10min。

9.根据权利要求8所述的DNA连接方法，其特征在于：DNA片段1为环状载体，DNA片段2为线性化的插入片段；a步骤中为1h-4h。

10.根据权利要求8所述的DNA连接方法，其特征在于：步骤如下：

(1)制备反应体系：每20μl体系中，包含如下组分：

余量为RNase free H₂O；

(2)进行如下反应程序：

a、37℃，1h或2h

b、37℃，10或5min

c、16℃，10或5min

d、重复b和c步骤6或12次；

e、50℃，10min；

f、65℃，10min。