[发明专利]一种在鼻咽癌检测中应用的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种在鼻咽癌检测中应用的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修饰转化试剂以及基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因和RASSF1A基因甲基化的试剂，并且在MSF1和RASSF1A基因的甲基化PCR扩增引物序列上都含有CpG序列。本发明同时使用联合使用MSF1和RASSF1A基因进行鼻咽癌检测时，灵敏度和特异性较单独使用MSF1或RASSF1A基因的灵敏度和特异性都明显提高。

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒及其应用。

背景技术

鼻咽癌作为是华南地区高发肿瘤，它的治疗以放疗为主，但对于分期靠后尤其是Ⅲ期以上，复发性肿瘤的治疗采用放化疗、手术等综合治疗的手段效果欠佳。所以早期诊断对于提高其临床治疗效果显得重要。EB病毒感染是诱发鼻咽癌的高危因素，但在临床实际工作中EB病毒相关检查的灵敏度、特异性较低，在鼻咽癌早诊方面发挥的作用有限，所以目前临床迫切需要鼻咽癌早期诊断的新方法。基因启动子区域CpG岛甲基化能使基因表达沉默，从而引起一系列细胞的分子水平事件。目前国际已经公认基因甲基化是肿瘤发生进展过程中的早期事件。因此通过检测基因的甲基化对于预测细胞的癌变已经开始应用在不同的肿瘤早期诊断上，例如通过外周血中游离DNA的基因甲基化早诊大肠癌；通过分析肺泡灌洗液细胞中基因甲基化早诊肺癌，等等。

发明内容

在本发明中提供一种在鼻咽癌检测中应用的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修饰转化试剂以及基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因和RASSF1A基因甲基化的试剂，并且在MSF1和RASSF1A基因的甲基化PCR扩增引物序列上都含有CpG序列。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括用PCR方法检测内对照参考基因的试剂，所述内对照参考基因优选为ACTB基因；检测所述内参基因的试剂包括一对非甲基化位点扩增引物、一条检测非甲基化位点探针。

在一种实施方式中，在MSF1和RASSF1A基因的甲基化PCR扩增的每个引物序列上都至少包括二个CpG序列，并且有一个CpG序列位于5’端；并且检测所述MSF1和RASSF1A基因的甲基化PCR扩增产物的每个探针上至少包括3个CpG序列，并且CpG不在探针的二端。

在一种实施方式中，检测所述ACTB基因的试剂包括扩增ACTB基因引物和探针：上游引物序列SEQ ID NO:5：AAAAAGGAGGTTGGAT；下游引物序列SEQ ID NO:6：CTCCCRCAAAACAACCAC；和检测探针序列SEQ ID NO:9：CCACCTTACCCTAAACACTACAAC。

在一种实施方式中，基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因的试剂包括扩增MSF1基因的引物序列和探针：上游引物序列SEQ ID NO:1：TTTTCGTCGTTGTTTTTCG；下游引物序列SEQ ID NO:2：ATAATCCCATCCAACTACG；和检测探针序列SEQ ID NO:7：TTAACCGCGAAATCCGAC。

在一种实施方式中，基于荧光定量PCR方法检测RASSF1A基因的试剂包括扩增RASSF1A基因的引物序列和探针：上游引物序列SEQ ID NO:3：GCGTTGAAGTCGGGGTTCG；下游引物序列SEQ ID NO:4：CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG；和检测探针序列SEQ ID NO:8：AAACGCGAACCGAACGAAACC。

在一种实施方式中，所述样品DNA来自于鼻咽组织和/或鼻咽拭子DNA。

在一种实施方式中，本发明提供上述试剂盒在鼻咽癌检测中的应用。

本发明同时使用联合使用MSF1和RASSF1A基因进行鼻咽癌检测时，灵敏度和特异性较单独使用MSF1或RASSF1A基因的灵敏度和特异性都明显提高。