[发明专利]多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法

说明书

本发明公开一种多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法，所述方法利用rDNA非转录间隔区的基因片段作为整合位点，把菌丝霉素NZ2114表达盒整合至毕赤酵母基因组得到的毕赤酵母菌株菌丝霉素表达量高、菌株稳定性好，解决了现有技术中利用毕赤酵母菌株构建菌丝霉素表达菌株过程繁琐、构建的表达菌株中菌丝霉素拷贝数低、表达量少、筛选工作量大、菌株不稳定的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法。

背景技术

菌丝霉素对革兰氏阳性细菌具有明显杀伤作用，尤其是对肺炎链球菌的杀菌效果与万古霉素和青霉素的杀菌效果相当，并且具有良好的盐离子耐受能力、pH稳定性和热稳定性。同时，菌丝霉素无细胞毒性、无溶血性及脑脊液渗透性好，是治疗革兰氏阳性细菌引起的疾病的潜在药物。而毕赤酵母表达系统作为最常用的蛋白表达系统之一，具有遗传背景清晰、基因操作简便、发酵工艺成熟、蛋白表达水平高、具有翻译后修饰等优点，适合菌丝霉素的大规模生产。

近年来，人们对利用毕赤酵母表达重组菌丝霉素开展了大量研究和应用，例如：中国专利授权号CN102191255B提供了一种毕赤酵母表达重组菌丝霉素的方法，但该方法存在以下问题：单拷贝整合，表达量低，筛选工作量大。中国专利授权号CN102409003B提供了一种毕赤酵母多拷贝表达重组菌丝霉素的方法，该方法通过构建四串联子载体表达菌丝霉素，能提高菌丝霉素的表达量，但也存在以下问题：载体构建过程繁琐，耗费时间，四串联子载体分子量增大，降低载体整合效率，筛选工作量大。而且上述两种方法都是以表达载体上AOX1启动子为整合位点，而在毕赤酵母基因组中只存在一个AOX1启动子序列，因此表达载体在基因组AOX1启动子序列上发生多次整合的概率极低，导致筛选菌株的基因拷贝数不高。同时，以毕赤酵母常用的几个整合位点（AOX1启动子、GAP启动子序列或His4片段）作为整合位点获得的多拷贝菌株，由于这些整合位点在基因组都只有一个拷贝，因此这些多拷贝菌株的载体整合片段都是相互邻近的，会由于同源重组的原因导致在传代过程中基因拷贝数逐渐减少，引起菌株不稳定。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法，旨在解决现有技术中利用毕赤酵母菌株构建菌丝霉素表达菌株过程繁琐、构建的表达菌株中菌丝霉素拷贝数低、表达量少、筛选工作量大、菌株不稳定的问题。

本发明的技术方案如下：

一种多拷贝表达载体，其中，包括：rDNA非转录间隔区基因片段(SEQ ID No.1)和菌丝霉素NZ2114表达盒。

一种多拷贝表达载体，其中，所述菌丝霉素NZ2114表达盒由菌丝霉素基因序列插入pPICzαA表达载体的α-因子信号肽C端形成。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述毕赤酵母的基因组整合有所述多拷贝表达载体。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母制备方法 ，其中，包括步骤：

A、对菌丝霉素NZ2114基因5’端进行Xho酶切处理，并对NZ2114基因3’端进行Xba酶切处理，同时对pPICzαA载体进行Xho和Xba限制性内切酶双酶切处理，然后将经Xho和Xba限制性内切酶双酶切处理的菌丝霉素基因片段连接至同样被Xho和Xba限制性内切酶双酶切处理的pPICzαA载体，构建单拷贝表达载体；

B、以毕赤酵母X33菌株基因组为模板，利用扩增引物扩增rDNA非转录间隔区基因片段（NTS片段），并通过扩增引物在rDNA非转录间隔区基因片段的5’端添加BamH酶切位点，并在3’端添加Bgl酶切位点，得到扩增产物；