[发明专利]用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用。本发明保护一种引物组合，包括13个引物对(26种引物)，26种引物依次如序列表的序列1至序列26所示。应用本发明提供的引物组合配套GeXP检测方法鉴定H5、H7和N9亚型组合9个NA亚型，具有高通量、快速、省时省力的优点，为快速鉴别H5、H7和N9亚型组合9个不同的NA亚型AIV提供了有效方法，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用。

背景技术

禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科A型流感，根据HA和NA抗原性不同，目前，已在禽类发现16个HA亚型和9个NA亚型，近年，在蝙蝠发现第17、18个HA亚型和10、11个NA亚型。1997年香港出现人类感染H5N1亚型AIV死亡病例，并爆发疫情，使人“谈禽色变”，给养殖业造成严重的经济损失。近年来，AIV感染人的病例陆续有报道，2013年，在我国长三角地区发现H7N9感染人并致死的案例，并在全国大部分地区扩散开来，已引起5波的感染，目前，仍有H7N9感染人的报道，给公共卫生安全造成严重的威胁。H9N2是AIV分离中常见的亚型，为近年感染人的H7N9、H10N8提供基因片段。

GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段(DNA SizeStandard,DSS)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。

传统检测H5、H7和H9亚型AIV及其NA亚型AIV的方法主要是病毒分离培养，经血凝试验和血凝抑制试验确定HA亚型，再将NA基因克隆至载体测序确定NA亚型，但耗时长并需要特定的阳性血清。如果能够利用GeXP多重基因表达遗传分析系统，建立一种能够同时检测多种H亚型和N亚型禽流感病毒的方法及其配套试剂盒，对于AIV的有效防控将具有重要意义。想建立上述方法，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。但是，基于本领域技术人员的公知常识，设计可以在同一体系中对多个靶片段进行有效扩增的多重PCR的引物组合是非常困难的。目前，还没有基于GeXP系统的同时可检测H5、H7、H9、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9亚型AIV的试剂或试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用。

本发明保护一种引物组合，包括如下13个引物对：

引物对AIV-M由正向引物和反向引物组成，正向引物为(a1)、(a2)、(a3)或(a4)，反向引物为(b1)、(b2)、(b3)或(b4)；

(a1)序列表的序列1所示；

(a2)序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；

(a3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；

(a4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；

(a3)和/或(a4)中，基因特异性引物如序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；