[发明专利]一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒及其制备方法

权利要求书

1.一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒，其特征在于，包括痘苗病毒天坛株TK基因的上游同源重组臂VTT-TKL和下游同源重组臂VTT-TKR，所述上游同源重组臂VTT-TKL和下游同源重组臂VTT-TKR间插入EGFP绿色荧光蛋白标记基因，所述EGFP绿色荧光蛋白标记基因由启动子P7.5启动表达。

2.根据权利要求1所述的一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒，其特征在于，所述打靶质粒还包括Luciferase报告基因，所述Luciferase报告基因也位于上游同源重组臂VTT-TKL和下游同源重组臂VTT-TKR之间，所述Luciferase报告基因由启动子P7.5启动表达，所述打靶质粒的核苷酸序列如序列表1所示。

3.根据权利要求1所述的一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒，其特征在于，所述打靶质粒的出发载体pMV-VTTTK-Luc。

4.一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒的制备方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：

步骤1，构建荧光标记示踪基因片段E-Luc片段，所述E-Luc片段的核苷酸序列如序列表2所示；

步骤2，将所述E-Luc片段用酶切连接的方法连接至pMV-VTTTK-Luc质粒中，得到痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒。

5.根据权利要求4所述的一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体按照下述方法进行：

步骤1.1，以pEGFP-Luc质粒为模板，根据Luciferase报告基因和EGFP绿色荧光蛋白标记基因的融合序列，设计引物；

步骤1.2，在所述引物的一端添加酶切位点EcoRI，在所述引物的另一端酶切位点XmaI，得到合成序列作为引物；

步骤1.3，以pEGFP-Luc质粒为模板，以所述合成序列为引物，经PCR扩增后，得到光标记示踪基因片段E-Luc片段E-Luc片段。

6.根据权利要求5所述的种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1.2中的合成引物为：

ELuc-F：5’-GGAATTCGCCACCATGGAAGACGCCA-3’

ELuc-R：5’-TCCCCCCGGGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3。

7.根据权利要求5所述的种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1.3中，PCR反应体系为：DNA 1μl，dNTP mix(2.5mM)1μl，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，5×PrimeSTAR buffer 10μl，PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5μl，加DEPC水至50μl。

PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55-60℃退火15s，72℃延伸1min/kb，循环30次；72℃延伸5分钟，最后置于4℃保存；

PCR片段回收：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收E-Luc片段。

8.根据权利要求4所述的一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒的制备方法，其特征在于，步骤2具体按照下述步骤进行：

步骤2.1，将pMV-VTTTK-Luc质粒经EcoRI/XmaI双酶切，凝胶电泳回收大片段作为载体；

将所述E-Luc片段进过EcoRI/XmaI双酶切，然后纯化回收获得连接片段；

步骤2.2，将所述载体和连接片段进行连接、转化，得到痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒。

9.根据权利要求8所述的一种痘苗病毒天坛株的示踪打靶质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2.2中将所述载体和连接片段按照分子克隆技术进行连接、转化。