[发明专利]用于免疫诊断试剂配制的肌钙蛋白I抗体的制备方法及获得的菌株

说明书

一种用于免疫诊断试剂配制的肌钙蛋白I抗体的制备方法及获得的菌株，制备步骤包括：(1)设计cTnI蛋白‑NH₂端41～56aa和80～95aa序列短肽作为免疫半抗原；(2)肽段与载体蛋白偶联；(3)免疫小鼠；(4)细胞融合；(5)腹水制备及单抗纯化，从小鼠体内抽取腹水后再通过粗纯和精纯化方法步骤，即获得纯度大于95％的单克隆抗体。本发明以目标肽段作为免疫原、主动避开各种干扰因素的影响，提高cTnI抗体所配制测定试剂的检测准确度，从而更高效地制备出用于配制检测特异性优良的cTnI测定试剂所需的抗体原料。

技术领域：

本发明涉及一种用于免疫诊断试剂配制的肌钙蛋白I抗体的制备方法及获得的菌株，具体是制备针对特定肽段表位的肌钙蛋白I单克隆抗体，并进行单抗筛选，得到能用于配制肌钙蛋白I测定试剂(免疫法)的抗体原料。

背景技术：

据世界卫生组织统计，目前冠心病是世界十大死因中排行第一的疾病，全球每年约有1700万人死于冠心病，被称为“人类健康的第一杀手”。急性心肌梗死(acutemyocardial infarction,AMI)是造成冠心病人死亡的主要原因。AMI典型病例可以根据病史、症状及心电图的特殊改变进行诊断，但大量的临床实践发现，约有25％的AMI病人发病早期并无典型的临床症状，约50％的AMI病人缺乏心电图的特异改变，在此情况下，检测血液中的心肌损伤标志物具有重要价值。目前，临床意义明确的心肌损伤标志物主要有肌红蛋白(MYO)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白I(cTnI)。由于在稳定性、特异性及灵敏度等方面的综合优势，cTnI已获得美国心脏协会(AHA)，美国心脏病学会(ACC)和欧洲心脏病学会(ESC)等众多权威组织的认可，逐渐成为AMI诊断的“金标准”。

肌钙蛋白(Tn)是骨骼肌和心肌收缩的调节蛋白，由三个结构不同的亚基通过非共价键结合组成，即肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白I(TnI)和肌钙蛋白T(TnT)。TnI和TnT又各有2种亚型，一种是在骨骼肌组织中表达的骨骼肌TnI(sTnI)和骨骼肌TnT(sTnT)，另一种在心肌组织中表达的心肌型TnI(cTnI)和心肌型TnT(cTnT)。临床研究表明心肌肌钙蛋白I以不同的复合形式存在，如cTnI-cTnC、cTnI-cTnT以及cTnT-cTnI-TnC等二元或三元复合物(如图1所示)。人cTnI蛋白含有210个氨基酸，相对分子量约为24KD。通过NCBI数据库检索人cTnI蛋白氨基酸序列如下所示：MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQELEREAEERRGEKGRALSTRCQPLELAGLGFAELQDLCRQLHARVDKVDEERYDIEAKVTKNITEIADLTQKIFDLRGKFKRPTLRRVRISADAMMQALLGARAKESLDLRAHLKQVKKEDTEKENREVGDWRKNIDALSGMEGRKKKFES(具体氨基酸序列见序列表7)。

cTnI蛋白的分子形态复杂多样，临床样本中的多种因素会对检测结果产生影响，包括TnI不同亚型干扰、cTnI与cTnC/cTnT蛋白形成复合物、cTnI蛋白降解、临床样本存在肝素干扰、cTnI蛋白磷酸化程度不同以及样本中自身抗体含量的个体差异性等因素(如图2所示)。制备针对合适抗原表位的抗体更有利于避开上述因素的干扰，以提高检测试剂的准确性，因此制备针对人cTnI特定肽段表位的单抗具有很大的临床应用价值。根据国际临床化学联合会(IFCC)统计不同厂家商品化cTnI试剂所用的抗体，针对的抗原表位主要分布在22～40aa，41～56aa和80～95aa三个肽段序列区域(从-NH₂端起计数，如图3所示)。目前cTnI单抗制备的主流方法是选择全长cTnI抗原作为免疫原进行小鼠免疫，获得抗体后再进行表位鉴定以筛选针对目标表位的抗体，该方法的优点是采用全长抗原作为免疫原制备获得高亲和力抗体的概率更高，但存在靶向性不强、获得目标表位抗体概率低的缺点。

发明内容：